Ш УНІВЕРСИТЕТ БУЕНО-ЕЙРС ФАКУЛЬТЕТ ТОЧНИХ І ПРИРОДНИХ НАУК 110 n одного з фіксацій oogglementqinmigganancia або immunocmmatogggia g дослідження вірусу перейдіть до Маріо Мама]. Реферат дисертації Закіна 1963 рік
UNIVERSIDAD DE-BUBNOS AIRES ФАКУЛЬТЕТ ТОЧНИХ І НАТУРАЛЬНИХ НАУК Застосування dg gg t6c3 gaa de tljggión do cggnlcnonto 1nnnnorluo ggggggcig і immunochronatosgggy для вивчення вірусу до ла відходів grcigg.
Спонсор дисертації: д-р Освальдо А.Песо
мета ÉES Y METONS le le 1) mguoreecemil e) Antigenoedricee Органи інфікованих тварин природи]. та експериментально чумою свиней. A Підручники, що використовуються у Le Prinre. частина досвіду походить від експериментально заражених енімеле та чумного мирного кіно. якщо станом на енілелею, що відноситься до еопепехової ноги, ці останні органи були емідодами з іншої країни дд. бали Для другої серії навчань свиней вагою 25 і 30 кг заражали 2 1. iqyeotedos eubeutáneemente. 17 суспензії вірусу чуми свиней LM13, що використовується: як завантажувальний матеріал на Laboratoriosmi. Enimlee був принесений в жертву між третім і восьмим днем після зараження, і поцілунки були зібрані. ганглій і нирка. б) сироватки та глобаліни А - сироватка гіперінну чуми свиней. отриманий шляхом щеплення вірулентного дефібрину у свиней, які вже мали певний попередній імунітет. aea вакцинацією, .бачити за хворобою. Сироватка була надана лабораторіям Fuerte Sancti Spiritu. // 9
B - Суоро до антипороїнного кролика, отримане послідовним посівом. з начо або плечем, з дозами нормальної свинячої сироватки. Добові дози коливались від 0,1 до 0,2 1, а кількість щеплень становило 16, вводили протягом півтора років. У першому щепленні він використовував оливки Фрейнда із співвідношенням 2 до 1 відповідно до ад'юванта. Титри, отримані шляхом зміни токсичності проепітину, коливались від 1/12800 до цілого навіть. кожна тварина була наступною: Іну. nl m1 N 'нац. Freund vi t1 m90 зробити щеплення 1-го. 1-й. 2 ac x) 2 0 1 '1P (x) 1 банан після 3 0. 1 o 1n (m) 2 an 4 O. 1 - o 2 nn 5 0.1-1p 3 nn 6 Q. 1 - m 2 nn 7 0.1 oo 2 a 8 0,15-1p 3 a 9 0. 15-13 2 nn 10 Oo15 - o 2 a 11 0,15 або 1p 3 nn 12 0,15-1! 2 n n 13 0,15 o o 2 n n 14 Oo2-1p 3 n n 15 0,2 c 1m 2 n n 16 0. 2 o e 2 u n (x) ao - euboutánnu (zz) 1p a intraporitonoal (xxx) 1. - intranusoulor llo
при кімнатній температурі, а потім конфігурують два шари осаду. 11. - очищення шляхом проходження через целюлозну колонку DEAE. згідно з технічним викладом Курцина (28). Целюлозу DEAE після промивання та доведення до рН 6 суспендували в 0,02 М буфері, рН 6 (фосфатний буфер). в той час як сполучена речовина. очищати. він був діалізований протягом ночі проти 1 такого ж глушника. Очищена фракція, що цікавить. Його розбавляли 0,02 МпН 6 буфером, тоді як домішки видаляли з колонки буфером рН 5,2, який вже був описаний раніше. Рідину концентрували до початкового об'єму шляхом діалізу проти Carbowax 20 M. I - Нормальна свиняча сироватка. отримані з леохонів від стад, вільних від чуми свиней. і нещеплені. о) Розчини та реагенти A- CIN .oososaoso сода-cos фосфат фізіологічний розчин. 801 8 P0HI. 0 0,00,0. - 2048 4 2 2 Дистильована вода esp. PH 7-8 "811 B - буфер карбонатобіокарбону до 1000 мл oooooooooooooooooo ÜO3HNh 0,000.000,00000000 Агус дистильована кришка. 400 м1 PH 9 G // 17
c - Буфер для діалізу кон'югованого білка cocoootneoe100,00.00.000032 g eeeoeeeeeeeeeeo 7,2g Aguad'atilad. капюшон. o.u40 0,1 PH 7 D - Верональний буфер для електрофорезу натрію. 7,33 г ацетату натрію. 01H0.1N. 4,86 г 45 л дистильованої води 750m1 ph 8,6 E o Реагенти, використані в модифікованому методоолорліновому тріо Коха та Мальбекіна (1924): - Розчин для травлення: 5% розчин мідного купоросу змішували зі 100 мл концентрованої та чистої сірчаної кислоти. Отриманий розчин обережно виливали в 100 мл дистильованої води. Контрольний розчин сульфату амонію: 9,4332 г чистого сульфату моніки та сео розчинили в 3043 році! 0,2 Н до 1000 м1. Розчин 80 32 0,2 N отримували розчиненням 5,6 1 концентрованої кислоти у воді до отримання 1000 мл. Цей концентрований розчин містив 2 мкл R на нл, і його потрібно було розвести, щоб використовувати його як контроль.Вода в 20 нл (40 мг N) концентрованого розчину сульфату амонію. Додавали 180 нл SO4H20.2N і доводили дистильованою водою до одного літра. Кожен мл цього розчину відповідав 0,04 Ig I. // 18
- Реагент Ніліра: 22,5 г йоду розчинили в 20 нл ана, що містить 30-5 ІК. Після завершення розчинення додавали 30 г Hgmetallic, і це було добре зроблено, уникаючи змішування його в гарячому стані, охолодження в жоповому струмі. Перемішування продовжували до тих пір, поки колір самого йоду не зник. Надосадову рідину зливали і реакцію тестували проти розчину крохмалю. Коли реакція негативна. у реагенті вийшла ртуть. тому він додав кілька крапель йоду тієї ж попередньої концентрації. Йод додавали до трохи позитивної реакції на крохмаль. Розчин розбавляли водою для заповнення обсягів використаного OHNeal lofil Buffere 200 мл, а потім змішували з двома в колонковій хроматографії або фосфатним буфером 0,2 MpH 6,3: 387 мл 0,2MPOHN 4 2 (A) розплавляли 112,5 мл від 0,2 до 204 HN32 (В); Таким чином, ми отримали 0,2 М фосфатний буфер рН 6,3. Від їсти. Розчину брали 100 мкл і додавали 1040 мл дистильованої води. фосфатний буфер 0,0175 MpH 6,3. - Фосфатний буфер 0,02 MpH 6: якщо було отримано 877 нл (A), їх змішували з 123 мл (B), отримуючи фосфатний буфер 0,2 H ph 6. Розбавляючи 100 1 і 1000 ll дистильованою водою і отримували буфер 0t02 l ph 6. // 19
- Буфер ph 5,2 0,00,0000000090000000 g CINE0,0,00,0,0,0,00000000000000 Вода PH 5,2 GBP 00.000.000. Всі матеріали, крім розчинів. їх зберігали замороженими при -20 с до моменту використання. Розчини знаходились при температурі 4 ° C. G 2) Eomglement fljgclon a) Вірусні антигени: Ті самі, що використовувались у імунофторозодонті. Всі антигенні матеріали піддавались такому процесу: I - подрібнена та 1/5 суспензія у вкрональному буфері 11- Заморожування при -20 O протягом 24 годин. Як мінімум. 111- Деонголяція. Центрифуга при 3500 об/хв протягом 15 хвилин с. IV-обробка 20% хлороформом. перемішування протягом однієї хвилини та центрифугування протягом 10 хвилин при 3500 об/хв для видалення хлороформу. V або Повторення того самого попереднього кроку, якщо непрозорість матеріалу робить це необхідним. VI - Центрифугування при 15000 об/хв протягом. 15 хвилин. 711-мінірування хлорофом-шуму мл за допомогою вакуумного насоса. b) Сироватка A або сироватка hyporinuno do чума свиней B - номінальна свиняча сироватка * // 2-е
G- Інші матеріали: комплемент кобуо, гемолітична система та верональний буфер ph 7. 6. були однаковими, що використовувались у звичайній роботі 1-ї серологічної секції Інституту хвороби на ящур, INTA (29, 30, 31). Комплемент отримували вдавленням 400 г жіночого медового ообайое або невагітної жінки. Зазначене доповнення названо!) За технікою 50! гемоліїв, описаних Oeler та співавт. (16) Адидодіетилбарбітуровий верональний буфер. 9200 с, розчинених в 1 літрі дистильованої води 0000,00. oeeooeeoeeoeeeeooo 2 6 eeoeoeeooee-eno.eoeee-eeoeee Dieülbarbiturate d. 00610 eeeeooo 6 г 01113. 167.600г 603м. 5,04 г доповнювали 4 літрами дистильованого галегасу та фільтрували. ЕТЛ еетерилізували. протягом 20 хвилин. g 3) Immungoorogtoggg ph 7,66 (для одного 1/5 використання) e) Antigenoe viriooe: Те саме, що використовувалось у двох раніше згаданих reeooions. Підготовка антигенів була подібною до підготовки антигенів для фіксації комплементу, за винятком // 21
на етапі I, в якому суспензії не виготовляли з фосфатним фізіологічним розчином ph7.8 - O. або замість буфера вероналу, ph 7. 6. b) Сироватки: A Hyperimne сироватка свинячої чуми B - свиняча нормальна свиня з матеріалами 012199: Фосфатний фізіологічний розчин. ph7.8 або 8. формула яких наведена вище. Методи 1) Імнофлуореаценціг-техніка Atom Prggoion; Хочу ковзати. 59 зробив відбитки на органі антальбрмонтелавуб за допомогою фокфатированного фізіологічного розчину. Мазки фіксували протягом 20 хвилин; при -20 c oo ацетону. Їх промивали бідостильованою водою, виймали і не зберігали при 4 ° C. Використаний метод був непрямим. Спочатку на мазок, вже закріплений, осідали краплі сироватки гіпоринону без маркування. Його залишали в холодній камері на 30 MmtogaJBQWngdn на 10 хвилин, залишали висихати і обробляли, знову у вологій камері з міченою речовиною. На цьому етапі інкубація становила 50 хвилин при 37 С. Його промивали предметне скло з бідеатильованою агою, дається висохнути і досягає 6,6 до його спостереження мікросопіон при температурі 40. // 22
Контроль Контроль проводили або звичайні сироватки '". 1 .- i. A.kfi ïü Ai seïaqá-wp та 8 нормальних свиней, а також проміжний контроль, виключаючи шар, тобто немічену гіперінфінітну сироватку. A Leltz fltzlor був використаний мікроскоп типу Ортолюкс, який має в якості джерела світла a; лампу 1/4 3 t Ï. 4 a - + 17; - C. 1 4 '18 + 1/52 4 + naad no - - gai 111 9 C dm - x 21,22 a. -. Í -. + 23 * + 1 a '24 25 «I-1/32 + t * - I- - '+ 26 + 1/5' - E 27 +> 1/40 4 á + 28 + 1/30 É td + 29 + 1/33 -; 3o 'F 1/24 + ag 31 + 1/30 i + e + + 32 1/40 + E - r + 33037039 34.35.40 - Від 0 до '+ .- = + -. + L.5 5' + -, _ + 4 + 38 1/18 1/38 "1/5 1/40-3 í - - '. + - + 41 + 1/60: í + a General Alvnr + 1/25 I + g + Fc a Фіксація комплементу IF s Imnofluoruccnce IC s Immochronatomfh I свині z Щеплення у свиней DDIH'I + 00. - позитивний корінний мамонт. позитивні сумнівні антиконплеменуми Коли в ще один рядок викладаю свої матеріали. це означає
щепленням у свиней було зв’язування комплементу (50% гемізис). Збіг обох тоніків становив 74,3%. Щодо техніки інфльнофлуоресеної. Стає очевидним, що його чутливість все ще набагато нижча, ніж при фіксації комплементу та порівнянні значень між методом інокуляції та імунофлюореозеї. збіг становив 43%, враховуючи дані, зазначені як Е у сумнівній категорії, а не позитивні чи негативні. По відношенню до техніки іннуноеронатограрії можна бачити, що на даний момент вона є менш чутливою. Порівняння результатів, отриманих чотирма методами. та відсотки відповідності. Вони знайдені в таблицях III, IV та V. dro eo CU DE II, активний серед чотирьох використовуваних теоній Позитивний Позитивний fi Позитивний fi Позитивний f у свиней у FC Coino. в IF Caine в IC Coino. 35], 26 74.3 15 43 11 31.5 GUÉDHD IV Порівняльна таблиця між нінокуляцією свиней та фіксацією комплементу Позитив у вухах Позитив у фіксації комплементу 5 (50%) 35 26 li '74 .3 4 // 38
20 тестів на розум несуть із використанням високоінфекційних матеріалів тварин, заражених високими дозами вірулентної малярії. Виявлення антигену у заражених експериментальних тварин 1, принесених у жертву в різний час після зараження, як це пояснюється в матеріалах для приготування їжі, у пункті В антигену, що використовується в імунофлюоресценції. Невищених та невакцинованих свинячих чум прищеплювали вірусом і приносили в жертву третім. четвертий п’ятий. шостий. сьомий і восьмий дні після щеплення. Забирали селезінку. мезентеріальних гангліїв та нирок зазначених тварин, і була зроблена спроба продемонструвати присутність антигену шляхом фіксації комплементу та імунофлюоресценції. Дані тварин, які мають досвід. Ані як клінічні розлади, які вони перенесли, наведені в таблиці VI. Клінічна картина ТАБЛИЦЯ VI тварин на момент забою Тварини Клінічні розлади Час до забою після зараження 181 немає 3 дні 132 ні 4 дні 183 ні 5 днів 184 темп. 41,5 0 6 днів 185 13011 113-410500 7 скажіть йому 166 темп. 42 С, загальний розпад 8 дін 187 ні 3 дні 188 ні 4 дні 189 ні 5 днів 190 темп. 41 С 6 днів 191 темп. 42 C 7 днів 192 i temp. 42,5 С, загальний деоаміон 8 днів