зниження

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Активація термогенної програми пов'язана зі зменшенням GSH
  • Виснаження GSH внаслідок лікування BSO вибірково впливає на жирову тканину і викликає реконструкцію її форми
  • Лікування BSO викликає побуріння жирових клітин та відшарування мітохондрій за допомогою Fox01
  • обговорення
  • методи
  • Клітинні лінії, лікування та трансфекція
  • Миші та лікування
  • Виділення мітохондрій
  • Визначення карбонілювання білка
  • Гель-електрофорез та вестерн-блот
  • Аналіз RT-qPCR
  • Визначення рівнів GSH
  • Потенціал мітохондріальної мембрани та тест на поглинання глюкози
  • імуногістохімія
  • Споживання кисню
  • Статистичний аналіз
  • Детальніше
  • Історія змін
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

Ця стаття оновлена

реферат

Жирова тканина має безліч метаболічних функцій і головним чином бере участь у регуляції енергетичного гомеостазу. Традиційна номенклатура має жирову тканину білого та коричневого кольору залежно від її макроскопічного вигляду. Біла жирова тканина (WAT) складається з білих адипоцитів і, як правило, вважається резервуаром енергії нейтральних ліпідів. WAT зберігає надлишок калорій для використання в інших тканинах під час дефіциту поживних речовин. Коричнева жирова тканина (НДТ) є в першу чергу місцем терморегуляції. BAT - це, по суті, окисна тканина, яка при повній активації використовує жирні кислоти, що зберігаються в коричневих адипоцитах, щоб сприяти активності роз'єднання білка 1 (Ucp1 або термогеніну), який розсіює мітохондріальний градієнт протону для отримання тепла.

WAT здатний досягти великої пластичності і зазнає постійного перебудови протягом життя у відповідь на багато подразників навколишнього середовища (наркотики, поживні речовини тощо) та на фізіологічні умови (наприклад, старіння, ожиріння). Несподівана присутність клітин з характерними коричневими адипоцитами була зазначена в WAT 4, 5. Тому класифікація адипоцитів нещодавно оновлена. Зокрема, бритові (коричнево-білі) або бежеві адипоцити - це назва, що використовується для розрізнення коричневих клітин, локалізованих у ВАТ, від білих і коричневих адипоцитів 6, 7. Важливо, що з такими фізіологічними подразниками, як фізичні вправи та вплив холоду, ВАТ може еволюціонувати до коричневого фенотипу 8, 9, 10, 11. Під час цього процесу (побуріння) експресія класичних генів BAT запускається в WAT, що збільшує споживання енергії та призводить до втрати ваги. Як результат, коричневе забарвлення ВАТ позитивно впливає на чутливість до ожиріння ожиріння, резистентність до інсуліну та гіперліпідемію 2, 12. Однак такі патологічні стани, як запалення та рак, також викликають потемніння ВАТ 13, 14, 15 .

Існує також великий новий консенсус щодо того, що метаболічно активна НДТ є у людей від новонароджених до дорослих 16, а нижчі рівні БАТ пов’язані з ожирінням та діабетом 17, 18. Це відновило інтерес до функції НДТ та наслідків її набору на загальний метаболізм енергії тіла. Збільшення витрат енергії за допомогою обсмажування WAT або активації BAT є привабливою метою зменшення ризику ожиріння та пов'язаних з цим патологій 17, 18 .

Складний шлях експресії генів контролює розвиток фенотипу адипоцитів та метаболічну відповідь на конкретні вхідні речовини. Нещодавно було показано, що індукція генів, що організовують метаболізм і диференціювання жирових клітин, індукується змінами у внутрішньоклітинному окисно-відновному стані 19, 20. Крім того, окисно-відновний потенціал, здається, модулює ефективність метаболізму мітохондрій 21. У цьому відношенні бурі адипоцитарні мітохондрії мають вищий рівень продукування активних форм кисню (АФК) і більш окислений стан порівняно з іншими типами клітин 21. Вплив холоду ще більше зміщує стан окисно-відновних мітохондрій коричневих адипоцитів до прооксидантного стану, і ця подія необхідна для належного функціонування мітохондрій BAT 21. Ці спостереження припускають дуже особливу характеристику НДТ для всіх інших тканин, які покладаються на свою функцію, щоб мати більш відновне середовище 22, 23 .

Глутатіон (GSH) - основна окислювально-відновна система дисульфіду тіолу у всіх типах клітин 24, і зміни в його концентрації широко відомі для сприяння диференціації клітин 25. В останні роки було показано, що багато аспектів фізіології жирової тканини тісно залежать від окислювально-відновної системи GSH 26, 27, 28. Диференціації адипоцитів сприяють умови, що сприяють окисленню внутрішньоклітинних компартментів 29. Зокрема, зміни у відношенні GSH до GSSG до окислювальних умов супроводжують адипогенез 28, 30, а виснаження GSH під час диференціації прискорює дозрівання білих адипоцитів і збільшує накопичення тригліцеридів 28. Цікаво, що всі стани, про які повідомляється для запобігання активації НДТ та/або підрум’янення ВАТ (наприклад, гострі фізичні вправи, вплив холодом, запалення та рак), самі по собі є стресовими ознаками, які пов’язані з окислювальним стресом і можуть спричинити значні зміни окислювально-відновний рівень GSH. стан умов окислення в плазмі та тканинах 14, 31, 32. Незважаючи на ці дані, роль GSH у модуляції активності НДТ та побуріння ВАТ абсолютно невідома.

У цьому звіті ми розглядали можливість того, що зменшення концентрації GSH може призвести до процесу побуріння. Ми показали, що рівні GSH знижуються під час побуріння жирових клітин і що лікування нетоксичним інгібітором синтезу GSH бутіоніну сульфоксиміну (BSO) індукує підвищення регуляції несегрегованих респіраторних генів (наприклад, Ucp1 та Ppargcla) в коричневих і білих адипоцитах . Важливо, що ми також виявили, що індукція окислювально-відновно-відновного фактору транскрипційного фактора Fox01 є важливою для реакції побуріння.

результат

Активація термогенної програми пов'язана зі зменшенням GSH

( A ) Рівні мРНК Ucp1 вимірювали за допомогою RT-qPCR в eWAT та BAT у мишей, що піддавалися впливу холоду (4 ° C протягом 20 годин). Дані подаються у вигляді складчастої індукції щодо контрольних мишей (21 ° C) і виражаються як середнє значення ± SD (n = 3 миші на групу; * p

( A ) Вміст GSH вимірювали за допомогою ВЕРХ у eWAT та BAT у мишей, оброблених BSO (20 мМ у питній воді) протягом 5 тижнів (ліва панель). Окислення білка визначали тестуванням залишків карбонілу методом Вестерн-блот-аналізу (права панель). Актин використовували як контроль навантаження. Далі наведені денситометричні аналізи нормалізованих актином імунореактивних смуг. Оригінальні промокання в повний зріст наведені у Додатку No. Фіг. S3. Дані подаються як nmol GSH/мг білків і виражаються як середнє значення ± SD (n = 4 миші на групу, * p

( A ) рівні мРНК Ppargcla, Ppara, Ucp1, Fgf21, Cidea та Dio2, вимірювані в жировій тканині мишей, оброблених BSO, протягом 24 годин (20 мМ у питній воді). Дані подаються у вигляді складчастої індукції відносно контролю та виражаються як середнє значення ± SD (n = 4 миші на групу; * p 10-4 клітин) і виражаються як середнє значення ± SD (n = 4; * p 3, 40. Цікаво, холодно встановлений термогенний пристрій у мишей та ізопротеренол у клітинах 3T3-L1 також характеризувався індукцією Fox01 (рис. 4А, В). Попередня обробка ефіром GSH, яку ми показали, щоб значно полегшити побуріння адипоцитів, змогла. що зниження GSH шляхом лікування BSO змогло ефективно регулювати рівні Fox01 як у адипоцитах WAT, так і в 3T3-L1, імітуючи те, що спостерігалося під час лікування, холоду та ізопротеренолу (рис. 4C).

( A ) Рівні Fox01 були виявлені вестерн-блот у eWAT та BAT у мишей, що зазнали холоду (4 ° C протягом 20 годин). Далі наведені денситометричні аналізи нормалізованих актином імунореактивних смуг. Оригінальні промокання в повний зріст наведені у Додатку No. Фіг. S5. Дані повідомляються як зміна в кратному рівні від eWAT 21 ° C і виражаються як середнє значення ± SD (n = 3 миші на групу, ** p 8, 9, 10, 11). прооксидаційні стани 14, 31, 32. Реакції на основі тіолу в значній мірі беруть участь у контролі багатьох клітинних процесів, включаючи диференціювання клітин 33, 34. .

Fox01 - чутливий до окислювально-відновного відновлення фактор транскрипції, який м’яко модулює ліпідний обмін у жирових клітинах 1. Індукція білка Ucp139 також бере участь у ролі Fox01 у метаболізмі жирової тканини. Відповідно, ми стверджували, що експресія пов'язаних з коричневими генами, таких як Ucp1, модулюється BSO за допомогою шляху FoxO1 у білих адипоцитах. Дійсно, добавки ефіру GSH ефективно обмежують активацію Fox01 та експресію гена Ucp1.

Загалом, наші висновки наголошують на вирішальній ролі окислювально-відновлювальної системи GSH в метаболічній адаптації адипоцитів через посилене розсіювання енергії. Клінічні випробування I фази з безперервною інфузією BSO показали, що GSH може виснажуватися без надмірної нормальної токсичності тканин 55, 56. Отже, завдяки своїй здатності розсіювати надлишкову енергію за допомогою відключення мітохондрій у WAT та BAT, BSO може розглядатися в майбутніх дослідженнях як препарат із сильним терапевтичним потенціалом для лікування метаболічних захворювань.

методи

Клітинні лінії, лікування та трансфекція

Миші та лікування

Усі експерименти на мишах проводились відповідно до прийнятого стандарту догляду за тваринами та за згодою відповідних національних комітетів (Міністерство турботи) та місцевих комітетів (Інституційний догляд та використання тварин, Університет Тор Вергата). Шістнадцять самців мишей C57BL/6 (віком від 1 місяця) (придбані у Harlan Laboratories Srl, Урбіно, Італія) були випадковим чином розділені на 2 групи: необроблені миші (контрольна група, n = 8 мишей) або миші, оброблені BSO (BSO, n = 8 мишей). Мишей, оброблених BSO, випадковим чином розділили на дві підгрупи: мишей, які отримували протягом 24 годин (n = 4 миші), або мишей, які отримували лікування протягом 5 тижнів (n = 4 миші). BSO подавали у питну воду з кінцевою концентрацією 20 мМ. Шість самців мишей C57BL/6 (віком 6 тижнів) були випадковим чином розділені на дві групи: групу кімнатної температури (контрольна група, 21 ° C) або холодну групу (4 ° C). Експозицію на холоді підтримували протягом 20 годин. Усі миші були розміщені в 12-годинних циклах світло/темно і мали вільний доступ до їжі та води. Після вивиху шийки матки тканини пояснили та негайно обробили.

Виділення мітохондрій

Мітохондрії сирої жирової тканини були отримані, як описано у Wieckowski et al. 58. Очищені мітохондрії від 3T3-L1 і T37i були отримані згідно з Kristian et al. 59 з деякими змінами. Коротко кажучи, клітини лізували при 4 ° С в буфері для гомогенізації (210 мМ манітолу, 70 мМ сахарози, 5 мМ HEPES, рН 7,4) з доповненням EGTA (Sigma-Aldrich), альбуміном 0,5% та інгібіторами протеази та фосфатази (Sigma- Aldrich)) і центрифугують при 600 xg протягом 3 хвилин при 4 ° C для гранулювання ядер та важких частинок. Супернатант збирали і центрифугували при 17000 x g протягом 17 хвилин при 4 ° C для грануляції мітохондрій, які потім промивали двічі центрифугуванням при 17000 x g протягом 15 хвилин при 4 ° C.

Визначення карбонілювання білка

Карбонільовані білки виявляли за допомогою набору Oxyblot (Merck Millipore, Дармштадт, Німеччина), як описано раніше 3. Коротко, 15 мкг білків реагували з 2,4-динітрофенілгідразином (DNP) протягом 15 хвилин при 25 ° C. Зразки проводили на 10% гелях SDS-поліакриламіду, а білки, дериватизовані DNP, ідентифікували за допомогою Вестерн-блот, використовуючи анти-DNP антитіло та відповідне кон'юговане з пероксидазою хрону вторинне антитіло.

Гель-електрофорез та вестерн-блот

Сирі мітохондрії, клітинні гранули, eWAT та BAT лізували в буфері RIPA (50 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 12 мМ дезоксихолевої кислоти, 0,5% нонідету Р-40 та інгібіторів протеази та фосфатази). Для SDS-PAGE використовували зразки білка з подальшим вестерн-блот. Нітроцелюлозні мембрани фарбували первинними анти-β-актиновими антитілами, Fox01 (Santa Cruz Biotechnologies), vDAC, Ucp1 (Abcam, Кембридж, Великобританія), pHSL, PKA-Ser-субстрати (Cell Signaling Technologies, Danver, MA, USA), GSH. (Enzo Lifescience, Farmingdale, NY, США) та 4-гідрокси-2-ноненальний (4-HNE) гістидин (обережно пожертвуваний професором Учідою, Школа біологічного землеробства, Університет Нагоя, Японія), усі розведені мембрани 1: 1000. інкубували з відповідними кон’югованими з пероксидазою хрону вторинними антитілами, а імунореактивні смуги виявляли за допомогою системи візуалізації Fluorchem після фарбування відібраним ECL реагентом для виявлення Western Blotting (GE Healthcare, Пітсбург, Пенсільванія, США). Імуноблоти, показані на малюнках, є репрезентативними принаймні в трьох експериментах, які дали подібні результати.

Аналіз RT-qPCR

Загальну РНК екстрагували за допомогою реагенту TRI (Sigma-Aldrich). Три мкг РНК використовували для ретро-транскрипції з M-MLV (Promega, Madison, WI). qPCR проводили у трьох примірниках із використанням перевірених праймерів qPCR (BLAST), Ex TAq qPCR Premix та ПЛР у реальному часі LightCycler II (Roche Diagnostics, Індіанаполіс, Індіана), як описано раніше 40. Рівні МРНК нормалізували до мРНК актину, а відносні рівні мРНК визначали методом 2-AAC .

Визначення рівнів GSH

Внутрішньоклітинні GSH та GSSG тестували після утворення S-карбоксиметильних похідних вільних тіолів з йодоцтовою кислотою з подальшим перетворенням вільних аміногруп у 2,4-динітрофенільні похідні реакцією з 1-фтор-2,4-динітробензолом, як описано вище. 60 .

Потенціал мітохондріальної мембрани та тест на поглинання глюкози

Для оцінки мітохондріальних трансмембранних клітин клітини інкубували з Mitotracker Red (Life Technologies Ltd) у концентрації 200 нМ (30 хвилин, 37 ° C) перед цитофлуориметричним аналізом. Для вимірювання поглинання глюкози клітини інкубували з флуоресцентним аналогом глюкози 2-NBDG (Life Technologies Ltd) у концентрації 100 мкМ (30 хвилин, 37 ° C) перед цитофлуориметричним аналізом.

імуногістохімія

Жирові тканини пояснювали і негайно фіксували на ніч у розчині формаліну (Sigma-Aldrich), промивали водою, зневоднювали та вкладали у парафін. Вкладені в парафін тканини розрізали на ділянки 7 мкм і забарвили гематоксиліном та еозином (H&E) або антитілом Ucpl. Показані зображення є репрезентативними для одного з чотирьох експериментів, що дав подібні результати. Розмір і кількість адипоцитів на площу розраховували за допомогою ImageJ (Adipocytes Tool).

Споживання кисню

Споживання кисню визначали в білих адипоцитах 3T3-L1 та коричневих Т37i, використовуючи кисневу електродну систему Oxygraph Plus (Hansatech Instruments Ltd, Норфолк, Великобританія). По закінченні диференціації клітини обробляли BSO протягом 24 годин, збирали і ресуспендували з повноцінним культуральним середовищем в оксиграфічній камері. Споживання кисню в реальному часі реєстрували при 28 ° C протягом 5 хвилин.

Статистичний аналіз

Результати представлені як середнє значення ± SD. Статистичну оцінку проводили ANOVA, а потім Студент-Ньюман-Кілз. Відмінності вважали значущими для Р