підвищує

  • реферат
  • Головний
  • методи
  • Тварини.
  • Навчальні групи.
  • Формули HPpCD.
  • Тестування викликаної реакції стовбура мозку.
  • Статистичні методи.
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • Звичайні коти.
  • Кішки з хворобою NPC.
  • Звичайні коти, які отримують траппсол.
  • ОБГОВОРЕННЯ
  • глосарій

реферат

2-гідроксипропіл-β-циклодекстрин (HPpCD) є перспективною експериментальною терапією хвороби Німана-Піка типу С, яка покращила внутрішньоклітинний транспорт холестерину, значно зменшила нейродегенерацію та захворювання печінки та збільшила тривалість життя мишей npc1 -/-. На підставі сприятливих результатів лікування у мишей HPβCD оцінюється як терапія у дітей із хворобою Німана-Піка типу С (NPC). Ми оцінили ефективність HPβCD на котячій моделі хвороби NPC і виявили дозозалежне збільшення порогів слуху, пов'язаних з терапією, як було визначено за допомогою тестування на викликану реакцію стовбура мозку (BAER). Для подальшої оцінки впливу HPpCD на слуховий поріг нормальним котам вводили підшкірно в дозі 4000 мг/кг або 8000 мг/кг маси тіла або інтратекально в дозі 4000 мг/кг маси мозку. HPpCD спричинив значне збільшення порогу слуху після одноразової дози 8000 мг/кг підшкірно або 120 мг внутрішньовенно, а ефект зберігався щонайменше 12 тижнів. Повторне щотижневе введення дози 4000 мг/кг HPpCD щотижня призводило до подібного збільшення порогу слуху. Ці дослідження першими описують специфічний негативний вплив HPβCD на слухову систему та припускають необхідність тестування слуху у пацієнтів, які отримують подібні дози HPβCD.

Головний

Циклодекстрини - це циклічні олігосахариди з гідрофобними внутрішніми середовищами, які використовуються як носії для збільшення кількості лікарського засобу, включаючи гормони та вітаміни, які можуть розчинятися у водних носіях (1). 2-гідроксипропіл-β-циклодекстрин (HPβCD) широко вивчався у гризунів, собак та мавп, де він, як правило, добре переносився при низьких дозах (1, 2). Щоденне внутрішньовенне введення вище 200 мг/кг спричиняло зменшення маси тіла, інфільтрацію піною макрофагів у легені, збільшення печінкових ферментів, збільшення клітин Куппфера в печінці та канальцеву вакуоляцію нирок у гризунів (1, 3, 4). Усі ці зміни були оборотними після припинення прийому HPβCD (1).

NPC, що зустрічається в природі, трапляється у котів, які мають дефектну мутацію NPC1 (2864G-C), з клінічними, невропатологічними та біохімічними відхиленнями, подібними до тих, що спостерігаються у підлітків, роблячи цю модель гомологічною до найпоширенішої форми захворювань. спостерігається у пацієнтів людини (10, 11). Тестування слухової реакції стовбура мозку при БА з хворобою НПК показало подовження центрального часу провідності без значної зміни порогового слуху порівняно з котами дикого типу (11). Оцінюючи ефективність HPβCD при лікуванні хвороби NPC у котів, ми спостерігали значне збільшення порогу слуху у тварин, які отримували повторні дози sc 4000 мг/кг. Наскільки нам відомо, негативний вплив HPβCD на слухову функцію не оцінювали жоден вид. У цьому дослідженні вивчались ефекти sc та інтратекального введення лікування HPβCD на BAER нормальних котів та котів з хворобою NPC.

методи

Тварини.

Коти були виведені в колоніях тварин у Школі ветеринарної медицини Університету Пенсільванії, Національних інститутах охорони здоров’я та USDA відповідно до рекомендацій щодо догляду за тваринами та досліджень. Експериментальний протокол був затверджений Комітетом з питань догляду та використання в Пенсільванії при Університеті Пенсільванії.

Усі досліджувані тварини були виведені з тієї самої лінії, яка була виведена для отримання котів з аутосомно-рецесивною спадковою хворобою типу С Німана-Піка (NPC). Всіх котів утримували при температурі 21 ° C з їжею та водою ad libitum, 12-годинними світловими циклами, з 12-15 змінами повітря на годину. Лейкоцити периферичної крові від усіх котів тестували у віці 1 дня на наявність помилкових мутацій NPC1 за допомогою аналізу ДНК на основі ПЛР (10). Кішки з двома копіями сенсорної мутації були класифіковані як уражені NPC, тоді як коти з однією копією мутації або без неї - як нормальні. Від гетерозиготного до гетерозиготного розведення вийшло ∼ 25% уражених і ∼ 75% нормального потомства.

Навчальні групи.

Нормальних котів поміщали в одну з п’яти досліджуваних груп (табл. 1). Група 1 (n = 7) мала 6 місяців і не отримувала жодного препарату. Група 2 (n = 3) отримувала разову дозу 4000 мг/кг маси тіла HPpCD sc у віці 6 місяців. Група 3 (n = 3) отримувала разову дозу 8000 мг/кг маси тіла HPpCD sc у віці 6 місяців. Група 4 (n = 3) отримувала разову дозу 4000 мг/кг ваги мозку (120 мг на 30 г ваги мозку) HPβCD інтратекально у віці 6 місяців. Внутрішньовенне введення було досягнуто знеболенням котів в/в пропофолом (до 6 мг/кг; Abbott Laboratories, Чикаго, Іллінойс). У мозочково-мозковий цистерну помістили 20 г спинного мозку та видалили 1,0 мл спинного мозку. 0,6 мл 20% HPpCD у фізіологічному розчині вводили інтратекально в мозочково-мозковий цистерну. Група 5 (n = 3) отримувала 4000 мг/кг маси тіла щотижня під час обстеження HPpCD, починаючи з 8-тижневого віку, загалом за сім доз.

Стіл в натуральну величину

Кішки, які постраждали від NPC, вже брали участь у клінічному дослідженні, що оцінює ефективність HPβCD при лікуванні захворювання. Всім котам давали препарат у віці не раніше 3 тижнів, до появи клінічних ознак захворювання, а потім препарат продовжували щотижня. Кішок помістили в одну з п’яти груп (табл. 2). Група 6 (n = 8) не отримувала HPpCD і служила контрольною групою для котів з хворобою NPC. Групи 7 (n = 5), 8 (n = 2) та 9 (n = 5) отримували щотижневу дозу 1000 мг/кг HPpCD маси тіла sc, 4000 mg/kg маси тіла HPpCD sc та 8000 mg/kg маси тіла HPpCD sc, відповідно. Група 10 (n = 2) отримувала 4000 мг/кг маси мозку (120 мг на 30 г маси мозку) HPpCD внутрішньотекально кожні 2 тижні (інтратекальні шляхи, описані вище).

Стіл в натуральну величину

Формули HPpCD.

Всі HPβCD вводили у 20% (мас./Об.) Розчині, розчиненому в 0,9% хлориду натрію. HPpCD було отримано від Sigma Chemical Co. і порошкоподібну форму (HPpCD-H107; Sigma Chemical Co. Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі) застосовували у всіх підконтрольних адміністраціях, а також у формі, випробуваній на культурі клітин (HPpCD-C0926; Sigma Chemical Co. Aldrich) інтратекальне введення. В якості контролю для введення фізіологічного розчину іншим нормальним котам вводили одночасно sc (n = 2) та інтратекально (n = 2) з однаковими обсягами фізіологічного розчину.

Для контролю можливих відмінностей між HPβCD, що випускається Sigma Chemical Co., продуктом, що використовується в опублікованих дослідженнях на мишах (8, 9), та схваленим FDA препаратом для використання у пацієнтів (клас Trappsol-Pharm, Development of Cyclodextrin Technologies, Inc, High Пружини). (FL), траппсол вводили чотирьом кішкам: одна доза 8000 мг/кг маси тіла sc (n = 2) та одна доза 4000 mg/kg маси мозку внутрішньовенно (120 мг для 30-грамової маси мозку; n = 2).

Тестування викликаної реакції стовбура мозку.

У звичайних котів дослідження BAER проводили через тиждень після введення HPpCD у групах 2, 3 та 4 протягом 12 тижнів і проводили щотижня в групі 5 протягом загальних 12 тижнів. У котів з хворобою NPC дослідження BAER проводили у віці 16 тижнів.

Статистичні методи.

Для опису даних були розраховані середні значення та SD значень попереднього часу, часу центральної лінії та сигналів V/I у кожній групі, а для порівняння даних між різними групами використано непарний двосторонній t-тест. Наведені значення значимості p

Репрезентативні слухові промови, викликані стовбуром мозку, викликали відповіді у нормальних котів після введення HPβCD (група 2-5). Записи для груп 2-4 були зроблені через 2 тижні після одноразового прийому препарату. Запис для групи 5 був зроблений через тиждень після шостої тижневої дози препарату. У групах 3, 4 та 5 спостерігалося зменшення амплітуди форми хвилі порівняно з необробленими котами (група 1). Зміни в групах 3-5 були настільки серйозними, що криві не завжди можна було надійно ідентифікувати (приклад наведено для групи 3).

Повнорозмірне зображення

Для груп 1-5 вимірювали поріг слуху, амплітуду хвилі V/I та час центральної провідності (табл. 3). Коти в групах 3 та 4 продемонстрували значне збільшення порогу слуху через 2 тижні після ін’єкції порівняно з неін’єкційними котами (група 1). Середній поріг клацання BAER у контрольних котів становив 66 дБ, тоді як у групах 3 та 4, які отримували 4000 мг/кг та 8000 мг/кг HPβCD, поріг збільшився до 79 та 81 дБ відповідно. Ця приблизно 13 дБ різниця між групами була статистично достовірною (с

Щотижневі пороги слуху після 4000 мг/кг щотижневого введення HPβCD (група 5; n = 3). Першу дозу вводили відразу після тестування порогу на тиждень 0. Повторне введення HPβCD призводило до поступового збільшення порогу слуху зі статистично значущим (p

У котів з котами NPC не спостерігалося збільшення порогу слуху після щотижневого введення 1000 мг/кг HPβCD (група 7; n = 5) порівняно з необробленими ураженими котами (група 6; n = 8). У обох котів, які отримували щотижня 4000 мг/кг (група 8; n = 2), спостерігалося збільшення порогу слуху, а у котів, які отримували щотижня 8000 мг/кг (група 9; n = 5), було статистично значущим (p

У нормальних котів, які отримували інтратекальний або sc траппсол, спостерігалися ненормальні вигини через 1 тиждень після введення. A показує моніторинг BAER безпосередньо перед інтратекальною ін’єкцією 120 мг траппсолу; B показує BAER у того ж кота через 1 тиждень. С показано моніторинг BAER безпосередньо перед ін'єкцією 8000 мг/кг траппсолу; D, показує BAER у того ж кота через 1 тиждень.

Повнорозмірне зображення

ОБГОВОРЕННЯ

HPβCD - це циклічні олігосахариди, що складаються з семи β- (1-4) глюкопіранозних одиниць (7). HPpCD мають гідрофільну зовнішність та гідрофобну внутрішню частину, що робить їх корисними для підвищення розчинності у воді гідрофобних молекул, таких як холестерин, стероїди та вітаміни (20). Дослідження in vitro з використанням β-циклодекстринів показали значне виведення холестерину з культивованих нейрональних (21, 22) та ненейрональних клітинних ліній (23–25). Показано, що HPβCD переживають гематоенцефалічний бар’єр in vitro (25) та in vivo з труднощами (7, 26). Однак у дослідженнях на гризунах β-циклодекстрини безпечно вводили інтратекально і використовували для поліпшення доставки ліків до мозку, включаючи анестетики, пептид галаніну та естрадіол (27-29).

Підвищений поріг слуху без зміни часу центральної провідності припускає, що пошкодження HPβCD сталося в периферичному слуховому проході (вушної раковини або восьмий нерв) і що можливі механізми втрати слуху включають прямий вплив на striae vascularis та його роль у підтримці іонного середовища в вушна рідина: простір, трансдукційні та рухові механізми внутрішніх та зовнішніх клітин волосся та/або збудливі структури у відділеннях слухового нерва. Визначення місця дії HPβCD у периферичній слуховій системі, ймовірно, буде першим кроком у подоланні токсичності застосувань HPβCD. Акустичне тестування на випромінювання було б корисним методом для оцінки функції зовнішніх клітин волосяних клітин у котів, але для цих досліджень воно не було доступним. Надалі слід проводити гістопатологію равликів для виявлення будь-яких патологічних змін.

Підводячи підсумок, виявлено, що втрата слуху після введення HPpCD є як дозозалежною, так і тривалою, і може бути обмежуючим фактором при застосуванні цього препарату у високих дозах для лікування хвороби типу Niemann-Pick. Тестування слуху рекомендується проводити пацієнтам, які отримують дози 4000 мг/кг HPβCD або вище, щоб оцінити вплив на поріг слуху у цих пацієнтів.