предметів

реферат

результат

У пацієнтів з холестазом спостерігається підвищений рівень АТХ у сироватці крові

Пацієнти з РВС та ПСК мали підвищену активність АТХ порівняно зі здоровими контролями (10, 2 ± 4, 4 проти 7, 3 ± 3, 4 проти 2,8 ± 1,4 нмоль-1 хв-1 у пацієнтів з ПБК, ПСК та контролем, P -1 хв -1, P 1 хв-1, P 1 хв-1, P 1 хв-1 у чоловіків, P = 0,01) і асоціювався з віком (r = 0, 31, P = 0, 012). В обох холестатичних групах, що аналізувались окремо, активність АТХ не залежала від віку та статі, хоча пацієнтів із цирозом печінки виключали (додаткова фігура 1). Однак, коли ми аналізували обидві холестатичні групи разом, активність АТХ збільшувалася у жінок (9, 6 ± 4, 4 проти 7, ± 3, 5 нмоль мл-1 хв-1 у чоловіків) і залежала від віку пацієнта ( r = 0, 258, P

сироватці

Аналіз ANOVA. Дані представлені у графіку коробки-вуса із середніми значеннями, позначеними центральною лінією.

Повнорозмірне зображення

Рівень аутотаксину в сироватці крові пов’язаний із тяжкістю захворювання печінки

У групі PBC активність ATX була вищою у пацієнтів з більшою тривалістю захворювання (r = 0, 327, P 1 хв. -1 у стадії некрозу, P 1 хв. 1 у стадіях A, B та C у Стадія Чайлда-П'ю; Р> 0,05 для всіх, додаткова фігура 3А), аналіз AUC визначив активність АТХ у сироватці крові як значущий провісник цирозу (AUC = 0,7; 95% ДІ = 0,60-0,79; P

Коефіцієнти кореляції Пірсона між активністю ATX та тривалістю захворювання печінки у пацієнтів з ( A ) PBC та ( B ) PSC. Порівняння активності АТХ у пацієнтів з цирозом та некрозом із ( C. ) PBC та ( D ) PSC. АНОВА. Дані представлені як середні значення ± SD.

Повнорозмірне зображення

Крім того, рівні ATX суттєво корелювали (всі P 1 хв - 1, P

Коефіцієнти кореляції Пірсона активності ATX та показники MELD у пацієнтів з ( A ) PBC та ( D ) PSC. ( B ) Оцінка ризику Mayo для PBC та ( Е ) Оцінка ризику Mayo для PSC. ( C. ) Порівняння активності ATX між респондентами UDCA та невідповідачами у групі PBC. АНОВА. Дані представлені у графіку коробки-вуса із середніми значеннями, позначеними центральною лінією.

Повнорозмірне зображення

Подібним чином у групі PSC активність ATX була пов'язана з тривалістю захворювання (r = 0, 204, P = 0,03; рис. 2C) і була значно вищою у пацієнтів з цирозом, ніж у пацієнтів без цирозу (9, 3 ± 3, 8 проти 6,6 ± 3,0 нмоль мл). -1 хв -1, P 1 хв-1 у класах A, B та C у класі Чайлда-П'ю). P> 0,05 для всіх, додатковий малюнок 3B). Аналіз AUC визначив активність ATX у сироватці крові як значущий предиктор цирозу у пацієнтів з PSC (AUC = 0,734; 95% ДІ = 0,63-0,83, P -1 хв -1). P −1 хв-1, з чутливістю 76,2% і специфічністю 68,0% (рис. 4B). Регресійна модель Кокса для підвищених значень ATX виявила коефіцієнт ризику (HR) 3, 87 (P

Порівняння активності ATX між пацієнтами, які досягли кінцевої точки під час спостереження (перенесли трансплантацію печінки або померли) та пацієнтами, які були живими наприкінці дослідження у групах ( A ) PBC та ( C. ) PSC. Робочі характеристики приймача (ROC) під кривою (AUC) у пацієнтів з ( B ) PBC та ( D ) PSC.

Повнорозмірне зображення

У нашому дослідженні рівень АТХ у сироватці крові був пов’язаний не лише з показниками задоволеності пацієнтів, але також був пов’язаний з кількома лабораторними показниками. Ми спостерігали значну кореляцію з рівнями ALP в обох групах та з рівнями AST у групі PSC. Більш високі рівні ATX корелювали з гіршою функцією печінки (нижчі рівні альбуміну в обох групах та вищі значення INR у пацієнтів з ПСК) та меншим числом тромбоцитів при концентрації PSC та гемоглобіну в обох когортах. Крім того, активність ATX суттєво корелювала з оцінками MELD в обох групах. Цікаво, що коли ми окремо аналізували некроз та хворих на цироз печінки, більшість асоціацій залишалися значними у пацієнтів із ранньою стадією захворювання печінки, але не у пацієнтів із цирозом. Це спостереження свідчить про те, що ATX є цінним показником ураження печінки навіть у пацієнтів без цирозу. Однак активність ферментів також була вищою у пацієнтів з цирозом та з більшою тривалістю захворювання в обох групах. Нарешті, AUC-аналіз визначив ATX у сироватці крові як значущий показник цирозу як у пацієнтів з PSC, так і з PBC. Єдиним винятком була відсутність статистичної значущості щодо шкали Чайлда-П'ю, розрахованої для пацієнтів з цирозом, що може бути пов'язано з невеликою кількістю осіб у кожному класі.

Раніше рівні мРНК ATX вимірювали в різних тканинах та органах, включаючи мозок, жирову тканину, легені, печінку, кишечник, нирки, яєчники та високі ендотеліальні венули. Однак джерело циркулюючого білка в нормальних умовах не встановлено 19. Недавнє дослідження показало, що кишкові ентероендокринні клітини можуть бути важливим джерелом активності АТХ у сироватці крові у чоловіків із холестазом 20. Експресія ATX in vitro може бути додатково індукована цитокінами, такими як TNF, активуючи шлях 21 NF-kb. На додаток до підвищеної експресії, підвищений рівень ферментів може бути наслідком зниження циркуляційного виведення. Доведено, що у мишей радіоактивно мічений ATX в значній мірі виводиться з кровообігу печінкою з періодом напіввиведення декількох хвилин. Вважалося, що ATX виводиться з плазми за допомогою рецепторів захоплення на ендотеліальних клітинах печінкового синуса, які також беруть участь у фіброзі печінки 22. На відміну від цього, ATX також був підвищений у печінці печінки щурів 21. Вплив ниркової дисфункції на рівень циркулюючого ATX малоймовірний, оскільки креатинін у сироватці крові не корелював з рівнем ATX у наших когортах.

Встановлено також, що експресія ATX посилюється при різних злоякісних захворюваннях, таких як лімфома, злоякісна меланома та рак молочної залози 23. Оскільки LPA сприяє розвитку та прогресуванню пухлини, припускають, що підвищена експресія ATX може призвести до гепатоцелюлярної карциноми 24. Однак нещодавно було показано, що експресія ATX є порівнянною в тканинах гепатоцелюлярної карциноми та околопухлинних фіброзних тканинах, і рівні ATX в системному кровообігу не змінюються після радіочастотної абляції пухлини 25. Через дуже низьку частоту гепатоцелюлярної карциноми у пацієнтів з РВС та ПСК ми не змогли проаналізувати вплив HCC на рівень ATX у наших когортах.

Підвищений рівень АТХ у сироватці крові також був виявлений у пацієнтів із захворюваннями печінки, такими як хронічна інфекція гепатиту С 26 та HCB-асоційований фіброз та цироз 8, 27. Наше дослідження розширює ці спостереження, демонструючи, що рівень циркулюючого АТХ підвищений у пацієнтів без цирозу та цирозу із хронічним холестазом. Цей висновок особливо важливий для пацієнтів з внутрішньопечінковим холестазом вагітності, у яких відсутні хронічні ураження печінки, але рівень АТХ дуже підвищений 12 .

Наше дослідження має деякі обмеження. Дані були отримані в результаті клінічного дослідження, яке не дозволяє визначити точні молекулярні механізми, що регулюють експресію АТХ у хворих на холестатичну хворобу. Крім того, дослідження стосується польських осіб, і наші висновки, безумовно, вимагають перевірки в інших групах. Наші висновки зосереджені на короткочасному та загальному (але не пов’язаному з печінкою) виживанні. Нарешті, використовувані засоби якості життя не спеціально розроблені для використання у пацієнтів з ПСК.

Нарешті, наше дослідження надає нові клінічні докази пруритогенної ролі осі ATX/LPA у патогенезі холестатичного свербежу. Використання перевірених анкет HRQoL дало нам унікальну можливість визначити основні асоціації між підвищеною активністю АТХ та іншими симптомами, пов'язаними з холестазом, такими як втома та когнітивний та емоційний спад. Тому інгібітори ATX або блокатори рецепторів LPA можуть використовуватися як терапевтичні засоби при лікуванні свербежу, а також інших непрацездатних симптомів, пов'язаних з хронічним холестазом. Крім того, активність ATX корелює з тяжкістю холестатичної хвороби печінки, виміряної як клінічними, так і лабораторними показниками, а також оцінкою ризику Мейо. Нарешті, ATX є важливим предиктором смерті та трансплантації печінки. Ці висновки не втручаються у ключову роль існуючих клінічних параметрів, але припускають, що АТХ може бути ще одним цінним показником ураження печінки та новим прогностичним маркером при хронічних холестатичних станах.

методи

пацієнтів

У цьому поперечному дослідженні ми включили дві незалежні перспективні когорти кавказьких пацієнтів з діагнозом РВС та ПСК. Ці особи працювали у двох центрах: відділенні печінки, Поморському медичному університеті в Щецині та відділі печінки та внутрішніх хвороб, загальному відділі, трансплантації печінки та хірургії медичного університету у Варшаві з вересня 2009 року до жовтня 2014 року. діагностовано згідно з критеріями EASL 31. Крім того, зразки крові 109 здорових кавказьких осіб (чоловіки/жінки: 51/58, середній вік: 42,6 ± 11,5 років), відібрані в Університеті Ерланген-Нюрнберг, слугували контролем активності АТХ у сироватці крові та загального рівня жовчних кислот. Письмова інформована згода була отримана від кожного суб’єкта, включеного в дослідження. Протокол дослідження був затверджений Комітетом з етики Поморського медичного університету і відповідає етичним рекомендаціям Гельсінкської декларації 1975 року (6 перегляд, 2008). Дослідження проводили згідно із заявою STROBE (Покращення звітів про спостережні дослідження в епідеміології).

Група PBC

Було вивчено сто вісімнадцять пацієнтів з РВС (чоловіки/жінки: 9/109; середній вік: 57,7 ± 11,4 року). У 53 (46,1%) пацієнтів з РВС цироз печінки підтверджено або гістологічно, або методами візуалізації (комп’ютерна томографія або УЗД черевної порожнини). Як показано в таблиці 4, у пацієнтів з РВС були значно підвищені холестатичні показники та незначно підвищені трансамінази. У хворих на цироз печінки 29 (54,7%) були у групі класу Child-Pugh класу A, 18 (34,0%) були в класі B-Child-Pugh та 6 (11,3%) були у класі C Childa-Pugha. групи. П'ятдесят три (49,5%) пацієнти з РВС не реагували на UDCA згідно з Барселонським визначенням 32 (дані відповіді на UDCA були наявні у 107 пацієнтів). Невідповідність до UDCA асоціювалась із наявністю цирозу (chi 2 = 8, 5, P = 0, 004), оцінка Чайлда-Пью (7, 2 ± 1, 6 бала у тих, хто не відповів, порівняно з 6, 1 ± 1, 4 бали, P = 0, 02) та оцінка ризику Мейо (6, 3 ± 1, 5 бала для тих, хто не відповів, проти 5, 5 ± 2, 0 бала для респондентів, P = 0, 03). Також був виявлений слабкий взаємозв'язок між реагуванням на UDCA та класом Чайлда-П'ю (chi2 = 5, 7, P = 0,05). Невідповідачі на УДХА не відрізнялись від відповідачів УДХА за статевою ознакою або за оцінкою MELD (дані не наведені).

Стіл в натуральну величину

Група PSC

Було вивчено сто п’ятнадцять пацієнтів з ПСК (чоловіки/жінки: 75/40; середній вік: 35,4 ± 13,3 року). Діагноз IgG4-пов'язаного холангіту був виключений на основі рівня IgG4 у сироватці крові. Як і слід було очікувати, пацієнти з PSC були молодшими за пацієнтів з PBC і включали більше чоловіків. У тридцяти (26,1%) пацієнтів з ПСК також був діагностований цироз: 16 (53,3%) були в групі класу Чайлд-Пью, 12 (40%) - у класі В і 2 (6, 7%) . ) були в групі С класу Чайлд-П'ю. Параметри холестазу були підвищені, а показники MELD та оцінки ризику Мейо у пацієнтів з ПСК були низькими. Ці дані зведені в таблицю 4.

Кількість пацієнтів, які отримували лікування в наших закладах протягом досліджуваного періоду, визначала чисельність груп. Потенційна плутанина або модифікатори ефекту були виключені, наскільки нам відомо: жоден із включених пацієнтів не мав інших захворювань, які могли б суттєво вплинути на показники ХКВ, таких як декомпенсований цукровий діабет, ниркова недостатність, що потребує діалізу, злоякісні новоутворення, серцева недостатність або. Клінічні дані, оцінки ризику Mayo для PBC та PSC та відповіді на анкети HRQoL були зібрані, коли пацієнти погодились взяти участь у дослідженні. Відсутні дані вказані, якщо такі є. Біохімія печінки, активність АТХ, рівні білка та концентрації жовчних кислот аналізували в сироватці крові від суб’єктів до голодування. Зразки, що належать до двох холестатичних груп, аналізували разом в одній дозі лабораторний персонал, засліплений клінічними даними.

Кількісне визначення активності ATX у сироватці крові

Зразкам крові давали згорнутися перед центрифугуванням при 4 ° C, а сироватку заморожували в аликвотах при -80 ° C. Активність ATX визначали кількісно в розбавленій сироватці шляхом дослідження сліпих клінічних та серологічних груп. Зразки сироватки інкубували з буфером, що містив 500 ммоль/л NaCl, 5 ммоль/л MgCl 2, 100 ммоль/л Tris (pH = 9,0) і 0,05% Triton X-100 протягом 60 хвилин при 37 ° C. Паралельні інкубації проводили в наявність та відсутність 1 ммоль/л лізофосфатидилхоліну (LPC) (14: 0). Активність лізофосфоліпазної ATX визначали шляхом вимірювання кількості вивільненого холіну, виявленого ферментативним флуориметричним аналізом, використовуючи холіноксидазу (2 од/мл), пероксидазу хрону (1,6 од/мл) та гомованільну кислоту як субстрати для пероксидази. Після додавання обох ферментів до буфера (що складається з 20 ммоль/л CaCl 2, 2 ммоль/л HVA, 50 ммоль/л 3- [N-морфоліно] пропансульфонової кислоти [pH = 8,0) і 0,1% Triton X-100), збільшення флуоресценції контролювали при 37 ° C на аналізаторі NOVOstar (збудження 320 нм та емісія 405 нм; BMG Labtech GmbH, Оффенбург, Німеччина). (Ендогенна) кількість холіну, присутнього у зразку без додавання LPC, віднімали від кількості, виміряної у присутності LPC. Відхилення між тестами було менше 15%, а відхилення в тесті менше 10%.

Кількісне визначення білка ATX

Вміст білка ATX у зразках сироватки визначали кількісно, ​​використовуючи оптимізований в домашніх умовах специфічний для ATX сендвіч-імуноферментний аналіз. Коротко кажучи, мікропланшетні планшети покривали антитілом до людського ATX (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота, США). Зразки та рекомбінантні стандарти ATX (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота, США) розбавляли у фосфатному сольовому розчині, що містив бичачий сироватковий альбумін та 0,05% Твін-20. Захоплений антиген виявляли за допомогою біотинільованих антитіл до людини ATX (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота, США) та стрептавідин-пероксидази хрону, використовуючи тетраметилбензидин в якості хромогенного субстрату. Наявність білірубіну та жовчних солей у холестатичних зразках не перешкоджало кількісному визначенню ATX.

Визначення жовчних кислот

Зразки крові для визначення жовчних кислот збирали в пробірки, покриті ЕДТА. Відразу після збору плазму очищали центрифугуванням при 4 ° C. Згодом один об’єм мурашиної кислоти 0,5 М додавали до зразків плазми. Потім зразки заморожували і витримували при -80 ° C до аналізів. Подальші аналізи проводили, як було докладно описано в інших місцях 33, 34, 35, 36 .

Оцінка якості життя, пов'язаного зі здоров'ям (HRQoL)

HRQoL оцінювали як загальними (Коротка форма дослідження медичних результатів-36, SF-36), так і анкетами для конкретних захворювань (PBC-40 та PBC-27) 37. Опитувальник PBC-40 містить 40 запитань у таких сферах: втома, пізнавальні, соціально-емоційні, свербіж та інші симптоми, причому вищі бали вказують на гірший рівень HRQoL. PBC-27 - це спрощена анкета для PBC 38. SF-36 - широко використовувана та перевірена анкета HRQoL, що включає 36 пунктів, розділених на 8 шкал. Бали можна отримати за кожною шкалою або згрупувати у 2 підсумкові оцінки: Підсумковий бал психічного компонента та Підсумковий бал фізичного компонента. Бали варіюються від 0 до 100, причому вищі бали вказують на кращий HRQoL 39 .

статистика

Дані представлені як середнє значення ± стандартне відхилення (SD) для безперервних змінних. Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення Stat-View-5 (SAS Institute, Cary, NC, US) та SPSS 20.0 (IBM Ehnigen, Німеччина), включаючи точний тест Фішера та ANOVA, коли це було доречно. Категоричні дані порівнювали за допомогою критерію Левена на рівність дисперсій, а для оцінки рівності середніх значень проводили як об'ємну дисперсію, так і t-тести з окремою дисперсією. Кореляційний аналіз проводили із застосуванням рангових методів Спірмена або Пірсона. Аналіз виживання проводили за допомогою регресійної моделі Кокса. Смерть та трансплантація печінки вважалися подіями. Часом спостереження був час до смерті, трансплантації печінки або останнього контакту з пацієнтом. Рівні граничного значення ATX у сироватці крові, що передбачають цироз печінки та загальну виживаність у пацієнтів з PBC та PSC, визначали, використовуючи аналіз області робочої характеристики приймача (ROC) під кривою (AUC). Розраховано зв'язок між рівнем ATX та загальним коефіцієнтом ризику виживання (HR). Для виявлення незалежних взаємозв’язків та коригування ефектів коваріатів було проведено багаторазовий аналіз лінійної регресії, що включає всі параметри зі значними кореляціями (P