Центрифугування - це метод седиментації, прискорений завдяки застосуванню відцентрової сили. Це стосується аналізу або розділення сумішей частинки, клітини, органели або молекули.

центрифугаці

Теорія центрифугування та кількісні аспекти: див. Luque, с.123 або Freifelder, с.298.

Інструментальний

1. Труби

Виготовляється зі скла або пластику. Хімічно стійкі (розчинники, реагенти) та фізично (натяг на високих швидкостях). Різні розміри та форми. Спеціальні пластмаси для високих швидкостей.

2. Центрифуги

Ви можете регулювати швидкість, час, температуру. Високі швидкості (10 2-10-10 об/хв).

3. Ротори

Два типи: кутовий або нерухомий кутовий ротор маятниковий ротор

Модальності

За швидкістю:

Приблизний критерій:
Низькошвидкісне центрифугування менше 10000 об/хв
Високошвидкісне центрифугування від 10 000 до 20 000 об/хв
Ультрацентрифугування більше 20000 об/хв

За призначенням:

1. Аналітичне центрифугування

Мета: вимірювання фізичних властивостей частинок, які осідають, таких як коефіцієнт їх осідання або молекулярна маса. Особливо у варіанті ультрацентрифугування аналітика.

Молекули спостерігаються через оптичну систему під час центрифугування. Трубки для центрифуги повинні бути кварцовими, щоб пропускати видиме та ультрафіолетове світло. Поворотний ротор, вертикальне спостереження.

2. Препаративне центрифугування

Найчастіше використовуються. Мета: ізолювати частинки, клітини або молекули для аналізу або подальшого використання. Загалом використовується більша кількість вибірки, ніж в аналітиці.

Залежно від середовища, в якому його центрифугують, і способу нанесення зразка:

1. Диференціальне центрифугування

(Також називається мобільним кордоном). Пробірку заповнюють зразком і центрифугують. Поведінка кожного компонента вибірки залежить від його форми, розміру, щільності і, логічно, про умови центрифугування. Отримують лише 2 фракції: осад і супернатант.

[Примітка: слово осад більше підходить для чогось нерозчинного, що випадає в осад центрифугуванням або іншими механізмами (наприклад, хімічна реакція); осад це правильніше для того, що було змушено піти на дно, але все одно було б розчинним; pellet - це англійське слово, що ущільнюється на дні в результаті центрифугування]

A додаток типовим є субклітинне фракціонування (розділення різних компонентів клітини, головним чином органел) (див. Луке або Альбертс) з використанням послідовних центрифугувань зі збільшенням швидкості.

2. Зональне або швидкість седиментації центрифугування

Зразок наносять тонким шаром на середовище для центрифугування, яке є градієнт щільності. Під дією відцентрової сили частинки осідають через градієнт, концентруючись у дискретних зонах або смугах. Ваша швидкість руху вперед (і, отже, механізм розділення) залежить від його розміру, форми та щільності; всі ці параметри об'єднані в коефіцієнт седиментації,

`" Коефіцієнт седиментації "= s = (" швидкість седиментації ")/(" відцентрове прискорення ")`

яка вимірюється в одиницях Сведберга (1 S = 10-13 секунд).

Центрифугування повинно закінчитися до того, як будь-яка з відокремлених частинок досягне дна пробірки. Окремі компоненти збираються окремо, дуже обережно відсмоктуючи різні смуги або, краще, проколюючи дно трубки та збираючи падаючу рідину у фракції.

Можна побачити анімацію розлуки.

Градієнт щільності створюється за допомогою градієнта концентрації: збільшення концентрацій, опускаючись по трубці, відповідного компонента. Для цього використовують сахарозу, хлорид цезію, альбумін, бичачу сироватку плода. або комерційні середовища, такі як Ficoll - синтетичний полісахарид -, Percoll, метризамід.

Ви можете підготувати:
ще розривний градієнт або в шахматному режимі, вручну
б) а безперервний градієнт, за допомогою пристрою, що утворює градієнт
в) а самостійний неперервний градієнт, якщо він створений центрифугуванням, як правило, одночасно з фракціонуванням зразка

А) Приготування безперервного градієнта щільності за допомогою змішувача.

Б) Нанесення зразка на градієнт.

В) Поміщення пробірок в нахильний ротор та центрифугування.

Г) Збір у частках відокремлених компонентів.

За допомогою цієї методики можна, наприклад, відокремити всі типи клітин крові, очистити життєздатну сперму, відокремити життєздатні та нежиттєздатні клітини від дезагрегованих тканин та зразків із суспензійними клітинами тощо.

3. Ізопічне або седиментаційне рівноважне центрифугування

Також використовується градієнт щільності, але в цьому випадку час центрифугування досить довгий (до 1 або 2 днів), щоб седиментаційний баланс (між відцентровою силою, гідростатичною тягою клітини та її дифузією). Для цього використовуються безперервні градієнти, які охоплюють весь діапазон щільності компонентів зразка: на дні пробірки щільність середовища повинна бути більшою, ніж щільність компонента. Таким чином, незалежно від часу центрифугування, частинки, клітини тощо. Вони ніколи не осядуть на дні, а натомість досягнуть стабільного проміжного положення на градієнті, де зосереджені в дуже вузькій смузі (краща роздільна здатність). Найбільш поширеним є змішування зразка з матеріалом, який буде формувати градієнт і генерувати самосформований градієнт одночасно з поділом. Потрібні дуже високі швидкості (ультрацентрифугування) для формування градієнта.

На додаток до більш високої роздільної здатності, цікавим у цій техніці є те, що вона розділяє виключно за щільністю компонентів зразка, які розташовані в положенні градієнта, де щільність середовища дорівнює його власній (ізопікніка = однакової щільності, грецькою мовою).

Порівняння та додаткова інформація:

Ротор кутовий, зазвичай.

Розлука головним чином на основі розміру, а також на коефіцієнті седиментації s, що залежить від маси (розміру × щільності) та форми. (виміряно в Сведбергах, 1S = 10-13 секунд)

Додаток: поділ типів клітин, субклітинне фракціонування (поділ органел), розділення високомолекулярних асоціацій тощо.

Ротор гойдалка.

Розлука як функція коефіцієнта седиментації s, що залежить від маси та форми. Градієнт запобігає конвекційному/дифузійному змішуванню: добре відокремлені смуги. Центрифугування припиняють до досягнення рівноваги. Максимальна щільність градієнта щільності компонентів зразка.

Додаток: поділ молекул нуклеїнових кислот, очищення нуклеїнових кислот тощо.

4. Бар’єрні методи

Швидкий метод, типовий, наприклад, при отриманні циркулюючої крові лейкоцитів, вільних від решти клітин крові. Це центрифугування через середовище постійної щільності (це можна розглядати як ступінчастий градієнт однієї стадії). Щільність цього шару повинна бути проміжною між щільністю типів клітин, які слід розділити. Для цього використовуються комерційні середовища, такі як Ficoll-Paque, Lymphoprep та багато інших, які, як правило, складаються із сумішей Ficoll (синтетичний полісахарид) та метризаміду (йодована синтетична сполука). Для відділення певних типів клітин доступні різні середовища з адекватною щільністю; наприклад, Nycoprep 1,077 для мононуклеарних клітин, Nycoprep 1,068 для моноцитів, Polymorhoprep для поліморфноядерних клітин або Nycoprep 1,063 для тромбоцитів.

Розрахунки

Перетворення швидкості обертання (обертів на хвилину, об/хв) на відцентрове прискорення (відносна відцентрова сила, RCF, без одиниць):

Такого самого розділення буде досягнуто в 2 різних центрифугах, коли FCR однаковий, а не якщо швидкість обертання (об/хв) однакова. Тому важливо давати умови центрифугування в FCR, а не в об/хв. .

FCR - це те, що в розмові називається «числом гесів», оскільки воно вимірюється з використанням прискорення сили тяжіння як одиниці, g. Це виражається таким чином, наприклад, "центрифугування 15 хв при 20000 г" (або "при 20000 × г").

Взаємозв'язок між ними залежить від радіуса ротора (виміряного від осі обертання до положення зразка в трубці) наступним чином:

Поділ шляхом центрифугування залежить від маси комірки (`m`), радіуса обертання трубки - або радіуса ротора - де розміщується зразок (` r`) і швидкості, яку досягає центрифуга (`` омега '') або `n`):

`F_c = m * a = (m * v ^ 2)/r = (m * e ^ 2)/(r * t ^ 2) = (m * phi ^ 2 * r ^ 2)/(r * t ^ 2) = (m * phi ^ 2 * r)/t ^ 2 = m * omega ^ 2 * r = `

`F_c` = відцентрова сила
`m` = маса клітини
`a = v ^ 2/r` = прискорення; для одиничної гравітаційної седиментації, `a = g =` 9,8 м/с 2 = 980 см/с 2
`v = e/t` = лінійна швидкість зразка в пробірці (см/хв)
`r` = радіус обертання, виміряний між середньою точкою трубки центрифуги та віссю обертання (см)
`e` = лінійний пройдений простір, якщо рух був лінійним (см)
`t` = час седиментації, який використовується при центрифугуванні (хв)
`phi` = кут, пройдений при русі обертання (радіани = кут, дуга якого дорівнює` r`); `phi = e/r`
`omega = phi/t` = кутова швидкість, оскільки рух є обертальним (рад/хв = хв -1)
`n` = швидкість обертання (обертів в секунду = об/хв, або обертів в хвилину = об/хв); `омега = 2пі \ n`

Розрахунок відносної відцентрової сили:

`FCR = F_c/(F_g) = a/(g) = (39,48 * m * n ^ 2 * r)/(m * 980 (cm)/s ^ 2) = 0,0403 * n ^ 2 * r \ \ cm ^ -1 * s ^ 2`

Якщо розділити звичайні одиниці виміру (швидкість об/хв і радіус в см):

Що зазвичай пишеться як `FCR = 11,19 * 10 ^ -6 * n ^ 2 * r` або` FCR = (n ^ 2 * r)/89365`
що передбачає, що "n" в об/хв, а "r" в см

Як приклад, давайте розглянемо розв’язану вправу:

Кількість `g`, досягнута в роторі центрифуги радіусом 5 см, що обертається зі швидкістю 10000 об/хв, становить:
`FCR = (10000) ^ 2 * 5/89365 = 5600xxg`

Зручно знати, як обробляти це перетворення.

Розрахунок FCR з об/хв, і навпаки, для різних радіусів обертання ротора.