вмістом

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Характеристика мікробіомів Макака фуската
  • Дієта в основному структурує мікробіом кишечника
  • Дієта матері структурує потомство мікробів
  • HFD зменшує потомство Кампілобактер
  • обговорення
  • методи
  • Експериментальний дизайн
  • Секвенування мікробіомів
  • Аналіз даних 16S
  • Кількісна ПЛР
  • Детальніше
  • прирости
  • Біопроект
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

  • дисбактеріоз
  • Порушення обміну речовин
  • мікрофлора
  • Харчування

реферат

Кишковий мікробіом - це унікальна екосистема та важливий посередник метаболізму та ожиріння у ссавців. Однак дослідження, що вивчають вплив харчування на утворення мікробіомів в кишечнику в ранньому віці, здебільшого відсутні, особливо на моделях приматів. Тут ми повідомляємо, що високожирна материнська або постнатальна дієта, але не саме ожиріння, структурує кишковий мікробіом нащадків у Macaca fuscata (японська макака). Отриманий мікробний дисбіоз лише частково коригується після відлучення від їжі контрольною дієтою з низьким вмістом жиру. Несподіване раннє вживання дієти з високим вмістом жиру зменшило кількість непатогенного кампілобактеру в кишках неповнолітніх, що свідчить про потенційну роль харчових жирів у формуванні коменсальних мікробних спільнот у приматів. Наші дані ставлять під сумнів концепцію мікробіому кишечника, що спричиняє ожиріння, і скоріше надають докази того, як материнське харчування сприяє створенню мікробіоти, що, в свою чергу, впливає на підтримку метаболізму в кишечнику.

Кишковий мікробіом - це міцна екосистема, населена майже 100 трильйонами бактерій. Ці коменсальні бактерії кодують ферментативні шляхи, що дозволяють метаболізму та синтезу жирних кислот і вітамінів 1, 2. Вважається, що при народженні вагінальні та калові мікробіотики від матері прищеплюють ротову порожнину новонародженого, що є основою мікробіоти кишечника у нащадків 3, 4. По мірі зростання дитини та введення нових продуктів харчування мікробіоми розширюються за багатством і різноманітністю і досягають стабільного стану незабаром після відлучення, відображаючи дорослі мікробіоти 5, 6. Вплив материнського гестаційного харчування, способу введення та лактації на філогенетичну структуру дитячого та юнацького кишкового мікробіома досі недостатньо досліджений на добре контрольованих моделях 3, 4, 5, 7 .

У цьому дослідженні ми виявили, що Mucaca fuscata (японська макака) є репрезентативною моделлю для вивчення мікробіому людини. Крім того, ми можемо дослідити роль материнського харчування під час вагітності та лактації у створенні ювенільного мікробіома. Ми виявили, що, хоча мікробіом структурований переважно на основі дієти, ми знаходимо стійкі зміни у неповнолітньому мікробіомі на основі харчування матері; ці стійкі зміни відбулися, незважаючи на співіснування наших неповнолітніх когорт. Ці дослідження сприяють розширенню роботи та свідчать про те, що дієта в значній мірі формує наш мікробіом. Ці дослідження надалі дають уявлення про те, як розвиток мікробіоми потенційно вплинув на розвиток дієти людини для сприяння виникненню метаболічних захворювань.

результат

Характеристика мікробіому Macaca fuscata

Щоб дослідити відносний внесок маніпуляцій з харчуванням матері та тіла у формування мікробіогенів у приматів, ми провели метагеномічні дослідження в нашій добре охарактеризованій моделі безпородних японських макак (Macaca fuscata) 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32. Ми вперше визначили порівняльну значимість M. fuscata у людини в кількох ділянках тіла, відібравши оральні, вагінальні та кишкові зразки у здорових невагітних дорослих приматів та виконавши 454 піросеквенування 16S рРНК разом з філогенетичним аналізом основних координат (PCoA ). Подібно до людей 2, 20, 33, але унікальним для мишей, ми спостерігали дискретну агрегацію мікроботів у ротовій порожнині, піхві та кишечнику, що означає, що ці ділянки тіла значною мірою утримують унікальні ніші населення, хоча таксони поділяються з деякими особами, що демонструють стілець. піхви (рис. 1а).

ДНК виділяли з мазків M. fuscata або H. sapiens, отриманих з кишечника (прямої кишки, колоректальної та калу), вагінальної або ротової порожнини. Секвенування 16S рДНК проводили за допомогою системи 454 FLXtitanium, а послідовності аналізували за допомогою програмного забезпечення QIIME. a ) Графіки PCoA, що показують бета-різноманітність зразків, взятих із кишкового (синього), вагінального (червоного) або ротового (оранжевого) мазків. Кількість тварин (n), що використовуються для кожної ділянки тіла, вказана в дужках у легенді малюнка. b ) Кількість бактерій, виділених з кишкової, піхвової або ротової порожнини M. fuscata (ця робота) або H. sapiens (за допомогою HMP, доступна на //www.hmpdacc.org/). Кожен штам представлений у філогенетичному дереві різним кольором. Загальна кількість матерів та цуценят, з яких було отримано характеристику мікробіонів, становила 50, зразки надходили з кількох частин тіла.

Повнорозмірне зображення

Далі ми порівняли таксони на кожній ділянці тіла із загальнодоступними даними Проекту людського мікробіома (HMP; hmpdacc.org). На рівні типу кишкові таксони були подібними і в них переважали Bacteroidetes та Firmicutes (рис. 1b). Однак на рівні роду були очевидні відмінності у Bacteroidetes. Зокрема, поява бактерій у людей та превотелли у макак є, швидше за все, відображенням харчових відмінностей. Бактероїди кодують ферменти для перетравлення насичених жирів та тваринних білків, які частіше зустрічаються у західній дієті 5, тоді як у метаболічних реконструкціях у Превотеллі переважають шляхи перетравлення рослинного ксилану та целюлози, які частіше зустрічаються у всеїдних дієтах M. fuscata та аграрне населення. населення Буркіна-Фасо 5. Ротова мікробіота була приблизно так само на рівні штаму, за винятком більшої відносної чисельності фузобактерій у людей (рис. 1б). Загалом, кишкові та ротові мікробні спільноти M fuscata подібні до людських.

Вагінальний мікроб M. fuscata містив менше лактобактерій, ніж у людей, був помітно різноманітнішим, ніж люди, і містив таксони, найчастіше пов’язані з кишковим мікробіомом. У той час як збільшення бактеріального різноманіття у вагінальному мікробіомі людини пов'язане з бактеріальним вагінозом 34, 35, інші примати (наприклад, бабуїни) несуть вагінальне мікробне різноманіття, подібне до того, що ми спостерігали у здорових вагітних макак 36. Об’єднання деяких вагінальних та кишкових зразків (рис. 1а) свідчить про те, що ці економічні профілі достатку у макак, швидше за все, пов’язані з анатомічними та гігієнічними відмінностями, що призводять до забруднення фекаліями.

Дієта в основному структурує мікробіом кишечника

Незалежно від ожиріння та резистентності до інсуліну, кластери HFDS (ожиріння, резистентність до інсуліну) та HFDR (бідний, чутливий до інсуліну) кластеризувались і відрізнялись від відділів CTD за PCoA (P = 0,001 згідно з дисперсійним пермутаційним багатофакторним аналізом (PERMANOVA)). 2a) . ). Ця знахідка була підтверджена ступенем альфа-різноманітності та видовим багатством, які не змогли виявити суттєвої різниці між дамбами HFDS та HFDR (додатковий малюнок 1b, c). Цікаво, що немає очевидних відмінностей у рівні циркулюючих запальних цитокінів у плазмі крові 37, що пояснювало б різну агрегацію залежно від дієти. Однак повідомляється про збільшення загальних жирних кислот (насичених, мононасичених, поліненасичених та незамінних) та n-6 жирних кислот для дам, які споживають HFD 38, що є ймовірним поясненням того, чому в мікрофлорах кишечника не виявлено звичок та стійкості до інсуліну .

Зразки кишечника були взяті з M. fuscata, який підтримувався на ізокаретичній дієті, що містить або 13% жиру (контрольна дієта), або 36% жиру (дієта з високим вмістом жиру). ДНК виділяли із вмісту кишечника та проводили піросеквенцію 16S рДНК (454 FLXtitan). Послідовності аналізували за допомогою програмного забезпечення QIIME. a ) Графік PCoA, що демонструє різні групи осіб з контрольною дієтою (CTD, зелена), поганою дієтою (HFDR, темно-синя) або дієтою з високим вмістом жиру (HFDS, світло-блакитна). Особи значно кластеризуються на основі дієти (Р = 0,001 за ПЕРМАНОВОМ). Кількість тварин у кожній категорії (n) подано в дужках легенди. b ) Графік, що демонструє різницю в ряді штамів між суб'єктами, які перебувають на контрольній дієті (CTD), дієті з низьким рівнем харчування (HFDR) та ожирінням із високим вмістом жиру (HFDS). Пояснення праворуч від графіку показують колір для кожної представленої бактерії.

Повнорозмірне зображення

Зразки кишечника були взяті з M. fuscata, який підтримувався на ізокаретичній дієті, що містить або 13% жиру (контрольна дієта), або 36% жиру (дієта з високим вмістом жиру). ДНК виділяли із вмісту кишечника та проводили піросеквенцію 16S рДНК (454 FLXtitan). Послідовності аналізували за допомогою програмного забезпечення QIIME. a ) Кладограма, отримана в результаті аналізу послідовностей LEfSe 16S. Зелені затінені ділянки вказують на бактерії з більшим рівнем захворюваності у тварин, які харчуються контрольною дієтою (CTD), тоді як сині затінені ділянки вказують на бактерії з більшим рівнем захворюваності у тварин, які харчуються з високим вмістом жиру (HFD). b ) Відносна кількість родів бактерій серед тварин, які харчуються контрольною дієтою (CTD, зелені смужки) або дієтою з високим вмістом жиру (HFD, сині смужки). Графічні графіки показують розподіл даних із лінією в центрі поля, що представляє середнє значення. Ліва сторона медіани вказує на третій квартиль, а права сторона - на перший квартиль. Рядки праворуч від вікна позначають 1,5 в інтерквартильному діапазоні нижнього квартиля, а лінії ліворуч - 1,5 у міжквартильному діапазоні верхнього квартиля. Окуляри представляють відхилення.

Повнорозмірне зображення

Дієта матері структурує потомство мікробів

6 місяців або до 1 року, що є приблизним еквівалентом розвитку у людини за наявності дорослої мікробіоти 3, 46 .

Повнорозмірне зображення

Враховуючи стійкість впливу впливу HFD на матері на отримані кишкові таксони нащадків, ми прагнули визначити, які представники роду та таксономічні шляхи метаболізму або моделі передачі призвели до цих висновків. Вибір функції Борута з метагеномних даних, отриманих за допомогою 16S, виявив виснаження HFD протеобактерій, зокрема Epsilonproteobacteria Campylobacter spp. та Helicobacter spp, разом із збагачувальними речовинами Ruminococcus та Dialister (рис. 5а). Під час подальшого вивчення метагеномних даних, отриманих за допомогою 16S, на рівні роду, ми виявили, що Campylobacter spp зменшився у нащадків після будь-якого впливу HFD або під час вагітності/лактації, або після відлучення (малюнки 5b та 6). Як і в нашій КХГ материнської групи (малюнки 2b та 3b), підлітки, які перебувають на відлученому CTD, мали подібний підвищений рівень трепонеми (малюнки 5 та 6). Аналіз кишкових таксонів товстої кишки у нащадків показав зниження рівня видового багатства (додатковий малюнок 2b) та різноманітності (додатковий малюнок 2c) при будь-яких рівнях впливу високих харчових жирів; це спостереження було підтверджено LEfSe (додатковий малюнок 2г).

Теплова карта, що вказує на зміни гендерного рівня між M. fuscata, який споживав або контрольну, або дієту з високим вмістом жиру під час вагітності/лактації та/або відлучення. Відносна кількість кожного роду позначається кольоровим градієнтом від сірого (низька чисельність) до червоного (велика кількість). Теплова карта, створена з використанням відстані Манхеттена та ієрархічного групування, базується на середньому взаємозв'язку. Легенда над гарячою картою вказує на материнську їжу та харчування після відлучення від дитини кожного представника. На основі дендрограми спостерігається скупчення зразків цуценят, які споживають контрольну/контрольну дієту, через більшу кількість кампілобактерів. Кількість неповнолітніх (n) у кожній когорті наведено в дужках у легенді малюнка.

Повнорозмірне зображення

Наші спостереження в сукупності оскаржують уявлення про те, що за своєю суттю існує "ожиріння" мікробіома, а скоріше підтримують нові дані від мишей та людей, які вказують на передачу та модифікацію взаємодії між дієтою та мікробною спільнотою, яка впливає на біологію хазяїна (ожиріння) 9, 24. Наші дані, які демонструють роль материнського харчування, а не ожиріння матері як такого, у формуванні кишкового мікробіома потомства у віці 1 року, узгоджуються з нашими попередніми висновками про його вплив на епігеном плода 27, 28, 30. Хоча ми раніше бачили, що після відлучення від їжі зворотне харчування може врятувати експресію генів, що беруть участь у циркадному шляху 27, 28, розворот після відлучення не регулює всіх змін в матці епігенома плода 30. Тут ми описуємо чергову стійку зміну потомства внаслідок материнського харчування, причому рід Campylobacter зменшується внаслідок материнського харчування. На додаток до наслідків для ролі мікробіоти у зміні епігенетики або навпаки, ці стійкі зміни в мікробіомі можуть підтримувати зміни в поведінці тривоги, які вже були описані 32. Загалом, ці дані розкривають потенційні шляхи перехресних переговорів між біологічними системами.

методи

Експериментальний дизайн

Секвенування мікробіомів

Зразки відбирали із шлунково-кишкового тракту (калу, підвищеної кишки, прямої кишки), вагінальної або ротової порожнини, а ДНК виділяли за допомогою набору для ізоляції ДНК Powersoil (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA). Зразки кишечника відбирали з останнього калу, вмісту просвітньої сторони висхідної ободової кишки та шляхом введення ватного тампона в пряму кишку після розтину. Зразки ротової порожнини та вагіни відбирали шляхом розривання тіла. Після екстракції ДНК 16S рДНК бактерій ампліфікували і штрих-коди з праймерами V3V5 використовували для ідентифікації зразків перед секвенуванням 454; отримані послідовності аналізували кількісним аналізом програмного забезпечення мікробної екології (QIIME) 56. Послідовність праймера V3V5 із малими штрих-кодами є такою:.

Аналіз даних 16S

Попередня обробка включала видалення показань без послідовності штрих-коду або праймера, з подальшим видаленням зчитувань довжиною менше 200 нуклеотидів і зчитуванням з мінімальною середньою якістю менше 20. AmpliconNoise 57 використовувався для виправлення помилок, внесених в ПЛР та піроконвенції, а також видалити химерні послідовності. Спочатку було розраховано відстань потоку та ієрархічно згруповано з повним з'єднанням. Потім був використаний алгоритм максимізації очікувань для усунення пірочастотного шуму, і показання були додатково скорочені до 400 пар основ. Помилка ПЛР була розрахована між послідовностями та кластеризована для надання вхідних даних SeqNoise. Потім помилки ПЛР видаляли кроком SeqNoise. Праймери та штрих-коди вирізали з дегумізованих послідовностей. Нарешті, розмиті послідовності були додатково згруповані шляхом повного групування зв’язків у оперативні таксономічні одиниці (OTU) на рівні схожості 97% за допомогою AmpliconNoise. ОТУ з'явився в 58 році. Таксономічне призначення кожної послідовності було усічено на найбільш конкретному таксономічному рівні з оцінкою достовірності щонайменше 85%.

Кількісна ПЛР

Крім того, ДНК, виділену з M. fusata, також піддавали ПЛР-ампліфікації для роду Campylobacter та універсальної 16S рДНК, як описано раніше 47, 65. Праймерами, використовуваними для специфічної для Campylobacter ПЛР, були C412F 5'-GGATGACACTTTTCGGAGC -3 'та C1288R 5'-GGATGACACTTTTCGGAGC-3'. Ці праймери генерували продукт 812 п.н., використовуючи 28 циклів ампліфікації ПЛР при 94 ° C протягом 1 хвилини, 55 ° C протягом 1 хвилини та 72 ° C протягом 1 хвилини. Універсальна 16S рДНК ампліфікували за допомогою описаних вище праймерів (16SuniversalFor та 16SuniversalRev) і генерували продукт 462 bp після 30 циклів ампліфікації при 95 ° C протягом 1 хвилини, 60 ° C протягом 1 хвилини та 72 ° C протягом 1 хвилини. Продукти ПЛР проводили на 3% агарозному гелі, що містить бромід етидію. Гель візуалізували та кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення для аналізу VisionWorks LS (Upland, CA) 66 .

Детальніше

Коди доступу: Метаагеномічні дані зберігались у базі даних BioProject під кодом приєднання PRJNA231152.

Як цитувати цю статтю: Ma, J. та співавт. Дієта матері з високим вмістом жиру під час вагітності постійно змінює мікробіоми потомства у моделі приматів. Нат. Комун. 5: 3889 doi: 10, 1038/ncomms4889 (2014).