регулює

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Ектопічна експресія DNMT1 у макрофагах, асоційованих з атеросклерозом
  • Макрофаг DNMT1 посилює розвиток атеросклерозу в мишачій моделі DNMT1 Tg
  • Макрофаг DNMT1 збільшує продукцію прозапального цитокіну
  • DNMT1-опосередковане метилювання промотора PPAR-γ
  • Розиглітазон запобігає виробленню прозапальних цитокінів, індукованих макрофагами DNMT1, та розвитку АС
  • Макрофаг DNMT1 сприяє виробленню запальних цитокінів та розвитку АС шляхом придушення PPAR-γ у макрофагах
  • Підвищений рівень DNMT1 та зниження рівня PPAR-γ у моноцитах, пов’язаних із хворими на АС
  • обговорення
  • методи
  • Збір та виділення моноцитів периферичної крові людини
  • Покоління трансгенних мишей
  • Миші та дієта
  • Кількісна оцінка атеросклерозу
  • Екстракція очеревинних макрофагів (ПМ)
  • Виділення макрофагів з жирової тканини або артеріального нальоту
  • Приготування Ox-LDL
  • Перетворення бісульфіту та піросеквенування
  • Клонування промотора PPAR-γ та аналіз репортерного гена
  • ПЛР у реальному часі
  • Вестерн-блот
  • Імуноферментний аналіз (ІФА)
  • Вимірювання ліпідів у плазмі крові
  • Статистичний аналіз
  • Детальніше
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

  • Серцево-судинні захворювання
  • Порушення обміну речовин

реферат

Атеросклероз (АС), поширений у всьому світі розлад, причинно пов’язаний із складними захворюваннями, включаючи ішемічну хворобу серця та інсульт 1, 2, 3. Запальні реакції, опосередковані макрофагами, відіграють ключову роль у розвитку AS 4, 5. Накопичення окисного ліпопротеїну низької щільності (ox-LDL) та макрофагів в артеріальній стінці відіграє важливу роль у патофізіології розвитку АС шляхом визначення утворення нальоту, прогресування та розриву 6, 7. На ранніх стадіях АС циркулюючі моноцити притягуються до ендотелію судин. Молекули адгезії судинних клітин та білок хемоаттрактантів моноцитів беруть участь у хемотаксисі моноцитів 1, 3. Макрофаги, які відрізняються від моноцитів інтимою, сприяють розвитку АС, секретуючи прозапальні цитокіни (наприклад, TNFα, IL-6 та IL-1β), поглинання холестерину та початок апоптозу 1, 3, 8. Придушення прозапальної активності макрофагів є ефективною стратегією профілактики та лікування АС 3 .

Макрофаги можуть бути класично активованими (M1) або альтернативно активованими (M2) 9, 10. Макрофаги M1 сприйнятливі до запального фенотипу, який виражає високий рівень прозапальних цитокінів (наприклад, TNFα, IL-6 та IL-1β), тоді як макрофаги M2 відіграють протизапальну роль, виражаючи високий рівень -запальні цитокіни (наприклад, IL-10 та Arg1) 10. Попередні дослідження показали, що дієта з високим вмістом жиру (HFD) або ожиріння може викликати макрофаги M1, тоді як цитокіни Th2, такі як IL-4 або IL-13, можуть поляризувати макрофаги M29. Гамма-рецептор, що активується проліфератором пероксисоми (PPAR-γ), також відіграє важливу роль у сприянні поляризації макрофагів M2 11, 12. Регуляція експресії або активності PPAR-γ забезпечує ефективний засіб контролю продукування запальних цитокінів макрофагами 11, 12 .

Нові дослідження зосереджувались на ролі експресії генів у регуляції активності макрофагів 8, 13, 14. Однак епігенетична регуляція активності макрофагів досі не з’ясована до кінця. Епігенетична регуляція, включаючи метилювання ДНК, пов'язує фактори навколишнього середовища (наприклад, стрес, дієта) із складними порушеннями (наприклад, АС, рак) 15, 16, 17. Метилювання ДНК цитокінів, головним чином у місцях динуклеотидів CpG, є найпоширенішою епігенетичною модифікацією геному 18, 19. CpGs часто збагачуються в промоторних областях і в перших екзон/5'-нетранслірованих областях генів 20. Промотори транскрипційно активних генів зазвичай гіпометилюються, тоді як гіперметилювання ДНК може призвести до замовчування генів 15, 19. De novo метилювання опосередковується ДНК-метилтрансферазами (DNMT) 3a та 3b21. Після визначення метилювання ДНК підтримується за допомогою мітозу, зокрема підтримуючим ферментом DNMT1 22, 23. Зміна глобального метилювання ДНК може регулювати захворювання, пов'язане з хронічним запаленням 16, 17. Однак роль ДНК-метилтрансфераз у поляризації макрофагів та розвитку АС до кінця не з'ясована.

У цьому дослідженні ми припустили, що DNMT1 може регулювати вироблення запальних цитокінів у макрофагах і впливати на розвиток АС. Щоб перевірити цю гіпотезу, ми створили модель миші із специфічним для макрофагів трансгеном DNMT1 або PPAR-γ. Ми також представили модель миші AS, годуючи мишей ApoE-нокаутом (ApoE -/-) атерогенною дієтою. Використовуючи експерименти in vitro та in vivo, ми визначили роль шляху DNMT1/PPAR-γ у розвитку AS.

результат

Ектопічна експресія DNMT1 у макрофагах, асоційованих з атеросклерозом

a ) Рівні мРНК DNMT1, DNMT3a та DNMT3b у макрофагах, отриманих з жирової тканини (ATM), у самців мишей C57BL/6, які годували нормальну дієту (ND) або дієту з високим вмістом жиру (HFD) протягом 12 тижнів (n = 5, *) P -/-) годували атерогенною дієтою протягом 12 тижнів (n = 5, *** P DNMT1

( a ) Трансген DNMT1 суттєво впливає на запальний шлях та сигнальний шлях PPAR. Трансгенні перитонеальні макрофаги дикого типу та DNMT1 виділяли та обробляли LPS (100 нг/мл) протягом 24 годин з подальшим аналізом мікрочарів Gar. Потім дані мікрочипів піддавали аналізу KEGG. Зокрема, змінені шляхи запалювання та сигнальний шлях PPAR з відповідними значеннями P відображаються, як зазначено. ( b ) Рівні цитокінів у плазмі ApoE -/- або макрофагів DNMT1 трансгенних (Tg DNMT1) ApoE -/- мишей, які годували AD протягом 12 тижнів (n = 6, * P DNMT1 миші (n = 6, * P DNMT1 (n = 6, *) P 11, 12 і був інгібований надмірною експресією DNMT1 у цьому дослідженні, згідно з аналізом експресії генів мікрочипів. За допомогою аналізів ПЛР у режимі реального часу ми продемонстрували, що PPAR-γ переважно експресується в макрофагах, а рівні мРНК трансгену DNMT1 значно інгібуються (рис Ми також підтвердили, що DNMT1 суттєво пригнічує експресію мРНК PPAR-γ та її цільовий ген CD36 (рис. 4b), але механізм, що пов'язує DNMT1 з експресією PPAR-γ, потребує подальшого з'ясування.

( a ) Відносний рівень PPAR-α, β та γ мРНК у трансгенних перитонеальних макрофагах WT або DNMT1 (n = 5, * P DNMT1 протягом 24 годин. Потім клітини збирали для аналізів на люциферазу. (N = 3, ** P DNMT1 (n = 5, * P DNMT1 у плазмі мишей ApoE -/- при АД значно ослаблені обробкою росиглітазоном (рис. 5а), тоді як Tg DNMT1 - супресивні рівні IL-10 у плазмі крові в основному врятовані розиглітазоном (рис. 5а). ми виявили ті самі результати в макрофагах, виділених з артеріальних бляшок вищезазначених мишей AS (рис. 5b), і підтвердили, що DNMT1 регулює вироблення запальних цитокінів за допомогою сигналізації PPAR-γ у перитонеальних макрофагах, оброблених ox-LDL (рис. 5c). Лікування in vivo розиглітазоном повністю врятувало порушений розвиток АС, спричинений трансгеном DNMT1 (рис. 5г).

a ) Рівні цитокінів у плазмі крові трансгенних ApoE -/- або макрофагів DNMT1 (Tg DNMT1) ApoE -/- оброблених Розі (ip, 12 мг/100 г маси тіла/2 дні) та АД протягом 12 тижнів (n = 6), * P DNMT1 миша. (n = 6, * P PPAR-γ) модель миші (рис. 6a, b). Як і DNMT1, трансген PPAR-γ у макрофагах не мав значного впливу на збільшення маси тіла (рис. 6в) або на профілі ліпідів у плазмі крові (наприклад, вільний та загальний холестерин, тригліцериди, фосфоліпіди та ефір холестерину) (рис. 6г ). Однак рівні прозапальних цитокінів, індукованих Tg DNMT1, у плазмі крові в основному запобігали додаванням Tg PPAR-γ в моделі ApoE -/- AS (рис. 6д). У той же час рівні IL-10 у плазмі Tg DNMT1 в плазмі крові Tg PPAR-γ (рис. 6д). Далі ми перевірили регуляторну роль шляху DNMT1/PPAR-γ у виробництві запальних цитокінів у макрофагах, що походять від артеріальних бляшок (рис. 6f), та макрофагах, стимульованих волом-LDL (рис. 6f, g). Для подальшого спостереження ефектів шляху DNMT1/PPAR-γ у розвитку AS мишей ApoE -/- Tg DNMT1 схрещували з мишами ApoE -/- Tg PPAR-γ для створення подвійної трансгенної моделі миші. Як і очікувалось, порушення прогресування АС, спричинене Tg DNMT1, запобігало Tg PPAR-γ (рис. 6h).

( з ) Відносний рівень мРНК DNMT1 ( a ), PPAR ( b ), IL-ip ( c ), Іл-6 ( d ), TNFα ( e ) та ІЛ-10 ( f ) в ізольованих моноцитах периферичної крові у пацієнтів з АС чи здоровими донорами (n = 25, * Р 17, 27. Однак цільові гени метилювання ДНК та їх роль у розвитку АС залишаються незрозумілими. У цьому дослідженні ми виявили, що DNMT1 був екктопічно виражений у асоційованих з AS макрофагах: макрофаг DNMT1 посилював розвиток AS шляхом придушення опосередкованих PPAR-γ протизапальних ефектів, і ці результати представляють потенційні терапевтичні мішені для AS.

Ми виявили, що експресія ДНК-метилтрансфераз (DNMT3a та DNMT3b) у макрофагах, отриманих із жирової тканини, індукується лікуванням HFD або факторами ожиріння. Цей висновок був подібним до результатів попереднього дослідження 17. Зокрема, ми виявили, що індукція DNMT1, підтримуючого ферменту метилювання ДНК 22, 23, була більш вираженою у макрофагах, ніж стимуляція DNMT3a та DNMT3b HFD. Що ще цікавіше, DNMT1, але не DNMT3a або DNMT3b, був індукований в моделі ApoE -/- AS. Попереднє дослідження припустило, що прозапальні фактори (наприклад, насичена вільна жирна кислота) або протизапальні цитокіни (наприклад, IL-4) можуть стимулювати або пригнічувати експресію DNMT3b (не DNMT3a). Інші дослідження 17, 28, разом з нашими висновками, припускають, що експресія ферментів, пов’язаних з метилюванням ДНК, регулюється індивідуально різними факторами. Детальні молекулярні механізми, що пов'язують HFD або ApoE з індукцією DNMT1, DNMT3a та DNMT3b, залишаються незрозумілими і повинні бути дуже складними.

Цілі DNMT1 є універсальними 18, 23. За допомогою мікрочипів та аналізу KEGG ми виявили, що на сигналізацію PPAR суттєво впливає DNMT1. Подальшим підтвердженням ми виявили, що PPAR-γ, але не PPAR-α або β, переважно експресується та регулюється DNMT1 в макрофагах. На щастя, ми виявили, що PPAR-γ, нижчий за DNMT1, може ефективно регулювати вироблення запального цитокіну в макрофагах та розвиток АС у моделі миші. Специфічний агоніст PPAR-γ також відігравав захисну роль у прогресуванні АС. Насправді серія запальних цитокінів (наприклад, TNFα, IL-1β, IL-6 та IL-10) була модульована за допомогою PPAR-γ 11, 12. Однак цитокін, який був найважливішим у регуляції активності макрофагів та розвитку АС нижче за DNMT1/PPAR-γ, залишається незрозумілим. Для вирішення цього питання в майбутньому необхідно визначити конкретну взаємодію цих цитокінів з антитілами або нокаутованими мишачими моделями.

У сукупності наші дані виявили ектопічну експресію DNMT1 в асоційованих з АС макрофагах. Вперше ми продемонстрували, що DNMT1 сприяв прозапальній активації AS-асоційованих макрофагів та прогресуванню AS на моделях мишей. Ми також виявили, що PPAR-γ був мішенню для метилювання ДНК, що регулюється DNMT1, і брав участь у опосередкованому DNMT1 хронічному запаленні та розвитку АС. Ці висновки висвітлили стратегії та методи лікування АС, що застосовуються для лікування АС.

методи

Збір та виділення моноцитів периферичної крові людини

Покоління трансгенних мишей

DNMT1 або PPAR-γ кДНК миші субклонували в конструкцію, що містить промотор CD11b людини, щоб направити експресію специфічного для макрофагів гена 29, 30. Трансгенна конструкція DNMT1, специфічна для макрофагів (Tg DNMT1) або PPAR-γ (Tg PPAR-γ), мікроін'єктувалася в ембріони C57BL/6 відповідно до стандартних протоколів, і засновників схрещували з диким типом штаму C57BL/6. Для порятунку PPAR- експресія γ у макрофагах мишей Tg DNMT1, мишей Tg PPAR-γ схрещували з мишами Tg DNMT1 для отримання подвійних трансгенних мишей (Tg DNMT1 + PPAR-γ). Ці експерименти були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин у Третьому військово-медичному університеті та проводились відповідно до затверджених керівних принципів.

Миші та дієта

Усі експерименти на тваринах були схвалені Комітетом з питань інституційного догляду за тваринами та їх використання у Третьому військово-медичному університеті та проводились відповідно до «Довідника з догляду та використання лабораторних тварин», виданого Національним інститутом охорони здоров’я США ( публікація). ні. 85–23, переглянута 1996 р.). Мишей утримували у приміщенні, що не містить патогенів, з 12-годинним світловим циклом, 12-годинним темним циклом та забезпеченими їжею та водою за бажанням.

Миші-нокаути ApoE (ApoE -/-) на фоні C57BL/6 були придбані в лабораторії Джексона. Мишей дикого типу C57BL/6 придбали в Центрі тварин Третього військово-медичного університету. Для дослідження ролі макрофагів DNMT1 або PPAR-γ у розвитку АС мишей Tg DNMT1 або Tg PPAR-γ поєднували з мишами ApoE -/-. Шеститижневих мишей годували атерогенною дієтою (дієта з високим вмістом жиру та холестерину: 45% енергії сала [16: 0 = 23, 3%, 18: 0 = 15,9%, 18: 1 = 34,8%, 18: 2 = 18,7%] та 0,2% (мас. /% Холестерину) 31. Після 12 тижнів атерогенної дієти мишей жертвували для плазми, аорти, епідидимального жиру та інших тканин.

Кількісна оцінка атеросклерозу

Згідно з попереднім дослідженням 32, мишей приносили в жертву після 12 тижнів годування атерогенною дієтою для аналізу розвитку атеросклерозу в корені аорти миші. Кровоносна система перфузувала PBS (100 мм рт. Ст.) Протягом 10 хвилин до видалення серця та аорти. Серце плюс корінь аорти та дугу аорти були вирізані, а серійні зрізи кореня аорти вирізані за допомогою кріостата Leica CM3050. Зрізи фарбували гематоксиліном та 0,5% олійно-червоним O (Sigma-Aldrich) для оцінки атеросклеротичної інтимної області синуса аорти. Площа атеросклеротичних уражень та О-позитивна зона Олійного червоного були кількісно визначені за допомогою програмного забезпечення Image-Pro Plus (Media Cybernetics).

Екстракція очеревинних макрофагів (ПМ)

Первинні ПМ були виділені, як описано раніше 13. Коротко кажучи, кожній миші вводили (ip) 2 мл 2,9% тіогліколату (# T9032, Sigma) в день 1 і жертвували на день 3. Після ip ін'єкції 5 мл свіжого середовища DMEM перитонеальні клітини збирали в посуд для культивування. Через дві години плаваючі клітини промивали PBS, а прикріплені клітини PM використовували для іншого експерименту.

Виділення макрофагів з жирової тканини або артеріального нальоту

Виділення стромальних судинних клітин з жирової тканини проводили, як описано вище. Виділення макрофагів (клітин F4/80 +) із стромальних судинних клітин проводили шляхом магнітної імуноафінної ізоляції антитілами проти F4/80, кон'югованими з магнітними кульками (MACS; Miltenyi Biotec). Клітини виділяли за допомогою колонок позитивного відбору (MACS) перед підготовкою клітинних лізатів для аналізу мРНК методом ПЛР у реальному часі.

Для збору імунних клітин аорти аорти збирали, очищали та перетравлювали, щоб звільнити клітини аорти, як описано раніше 33. Потім клітини F4/80 + збирали вибірково, як описано вище.

Приготування Ox-LDL

ПЛР у реальному часі

Загальні РНК виділяли за допомогою набору peqGold Total RNA Kit, включаючи розщеплення ДНКази (Peqlab, Ерланген, Німеччина). РНК транскрибували в кДНК за допомогою Omniscript (Qiagen, Hilden, Німеччина). Рівні MRNA визначали за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі (qPCR). GAPDH використовували як внутрішній контроль, а рівні експресії генів обчислювали методом delta-Ct. Рівні мРНК для кожного гена представляли кількість відносно кількості в контрольній групі, яка була довільно стандартизована до одиниці. Послідовності праймерів, використовувані для qPCR, доступні за запитом.

Вестерн-блот

Тканинні та клітинні білки екстрагували за допомогою буфера лізису RIPA (# P0013, Beyotime, Китай) та кількісно визначали за допомогою набору BCA (# P0009, Beyotime, Китай). Зразки білка відокремлювали електрофорезом у поліакриламідному гелі на 10% і переносили на мембрану PVDF (Millipore). Після блокування 5% молока у забуференному трис фізіологічному розчині, що містить 0,1% Твін-20 (TBST), мембрану інкубували з первинними антитілами до DNMT1 (№5032, Cell Signaling Technology). Комплекс антиген-антитіло було виявлено Western Lightning Plus-ECL (PerkinElmer) з GAPDH (# 5174, Cell Signaling Technology) як білок внутрішнього контролю. Сигнали фіксували за допомогою системи Bio-Rad ChemiDoc MP (170-8280).

Імуноферментний аналіз (ІФА)

Цитокіни плазми вимірювали, використовуючи набори ІФА TNF-α (# MTA00B), IL-1β (# MLB00C), IL-6 (# M6000B) та IL-10 (M1000B), згідно з протоколами виробника.

Вимірювання ліпідів у плазмі крові

Дотримувалися протоколів виробника для вимірювання рівня тригліцеридів (тригліцеридний реагент, Sigma # T2449; вільний гліцериновий реагент, Sigma # F6428), загальний холестерин (рідкі реагенти для холестерину, Pointe Scientific Inc. # C7510-120), вільний холестерин (WaKo # 435) . -35801) та фосфоліпіди (фосфоліпідний реагент С, Wako # 433-36201) у зразках плазми.

Статистичний аналіз

Усі дані виражаються як середнє значення ± SEM і були проаналізовані або одностороннім ANOVA, або неспареним двостороннім тестом Стьюдента. Для кожного параметра всіх даних результати були значущими при * P