предметів
реферат
Дослідити механізм виснаження ліпідів цинком-α2-глікопротеїном (ZAG).
дизайн:
Дослідження проводили на мишах ob/ob або на ізольованих адипоцитах цих тварин або їх бідних аналогів.
результати:
висновок:
Ці результати дозволяють припустити, що ZAG не тільки індукує прямий ліполіз, але й сенсибілізує жирову тканину до інших ліполітичних подразників.
Ожиріння та його наслідки для здоров’я є основною проблемою для західного світу, і, як вважають, причиною є як генетичний вплив, так і вплив навколишнього середовища. Ожиріння пов’язане з резистентністю до інсуліну та діабетом 2 типу завдяки вивільненню неестерифікованих жирних кислот та прозапальних цитокінів з адипоцитів. Сучасний підхід до управління передбачає зміну способу життя у поєднанні з фармакологічним втручанням, хоча можливості лікування обмежені.
Показано, що ZAG викликає втрату жирової тканини за рахунок ліполітичного ефекту на WAT, у поєднанні з підвищеною експресією роз'єднання білка-1 в BAT, що призведе до збільшення витрат енергії. 3, 15 Ліполітичний ефект виникає внаслідок активації аденилілциклази з утворенням циклічного АМФ у процесі, що залежить від гуанозинтрифосфату 4, який послаблюється специфічним антагоністом p3-AR SR59230A, 16, припускаючи, що він опосередковується p3-AR. Використовуючи мишей ob/ob як експериментальну модель, це дослідження оцінює вплив ZAG на ліполітичні ферменти та чутливість адипоцитів до ліполітичних стимулів.
Матеріали і методи
матеріалів
Гіперглікемічних (ob/ob) мишей з ожирінням (73-77 г; таблиця 1) поселяли у власній колонії. Походження та характеристики цих тварин були детально описані раніше. Експресія гена ob на цьому тлі викликає більш важку форму діабету, ніж миші C/BL/6J ob/ob. Мишей розміщували в приміщенні з кондиціонером при температурі 22 ± 2 ° C і годували вільно, щурячих щурів та мишей (Special Diet Services, Witham, Великобританія) та водопровідну воду. Самців мишей (віком від 20 до 21 тижня) розділяли на трьох у клітку і вводили ZAG (35, 50 або 100 мкг щодня) шляхом внутрішньовенного введення (n = 6) або забуференного фосфатом сольового розчину (PBS) (n = 6). Вага тіла та споживання їжі та води, а також температура тіла щодня контролювали за допомогою ректального термометра (RS Components, Northants, Великобританія), а також вимірювали вихід глюкози в сечі.
Стіл в натуральну величину
Визначення складу тіла
Склад тіла визначали гравіметрично, як описано вище. 3 Коротко, після завершення, тварин нагрівали до 80-90 ° C до досягнення постійної ваги, а вміст води визначали з різниці між вологою та сухою масою. Ліпіди екстрагували із висушеної тушки екстракцією хлороформом/метанолом (1: 1), етанолом/ацетоном (1: 1) та діетиловим ефіром; розчинники об'єднували і випаровували. Вага залишку давала загальний жир із туш, а вага нежирної маси з туш обчислювали як різницю між початковою масою туші та вагою води та жиру.
Виробництво та очищення рекомбінантного ZAG людини
Клітини людини HEK 293F трансфікували вектором експресії клітин ссавців pcDNA 3.1, що містить ZAG людини, і відбирали для росту в неоміцині (50 мкг-1) у середовищі Фрістайл в атмосфері 5% CO 2 на повітрі при температурі 37 ° C. культуральне середовище поступово збільшувалось з часом до рівня плато протягом приблизно 2 тижнів після щеплення. Клітини видаляли центрифугуванням при 700 g протягом 15 хвилин і середовище (200 мл) концентрували до об'єму 1 мл стерильного PBS, використовуючи відцентровий фільтр Amicon Ultra-15 10 кДа (Millipore, Watford, Middlesex, UK). Потім концентрат (що містить приблизно 2 мг білка) додавали до діетиламіноетилцелюлози (2 г), суспендованої в 20 мл 10 мМ трис, рН 8,8, і перемішували при 4 ° С протягом 2 годин. ZAG зв'язується з діетиламіноетилцелюлозною целюлозою, яка осідає центрифугуванням (1500 г протягом 15 хвилин) і елююється при перемішуванні протягом 30 хвилин при 4 ° C з 20 мл 10 мМ Трис, рН 8,8, що містить 0,3 М NaCl. Після седиментації надосадову рідину, що містить ZAG, концентрували до обсягу 1 мл у стерильному PBS за допомогою відцентрового фільтра Amicon. ZAG не містив ендотоксину, як визначено за допомогою одноразового тестового набору LAL Pyrogent (Lonza). Чистота рекомбінантного ZAG становила> 95%, як описано вище. 15
Отримання адипоцитів людини та миші
Жирову тканину подрібнювали на дрібні фрагменти і перетравлювали у бікарбонаті Кребса-Рінгера, що містив 1 г 1-1 колагенази та 4% бичачого сироваткового альбуміну під 95% кисню/5% CO 2 при 37 ° C, як описано. Через 30 хвилин адипоцити фільтрували через капронову сітку (розмір пор 250 мкм), центрифугували при 500 г протягом 2 хвилин і тричі промивали PBS перед суспензією в середовищі RMPI 1640, що містить 10% плодової телячої сироватки, і витримували в атмосфері . 5% CO 2 на повітрі при 37 ° C. Живильне середовище замінювали щодня. Кількість адипоцитів визначали за допомогою гемоцитометра.
Ліполітичний тест
Для ліполітичних аналізів від 105 до 2 х 105 адипоцитів інкубували з ліполітичним реагентом протягом 2 годин в 1 мл бікарбонатного буфера Кребса-Рінгера, рН 7, 2, і ступінь ліполізу визначали шляхом вимірювання вивільнення гліцерину, вираженого як мкмоль гліцерину на літр. 105 адипоцитів за 2 години. 19 Для визначення спонтанного вивільнення гліцерину аналізували контрольні зразки, що містять лише адипоцити.
Ліполіз in vivo шляхом прямого введення індикатора в жирові прокладки
Вестерн-блот-аналіз
Щойно висічений WAT промивали в PBS і лізували в екстракційному реагенті фосфосафе протягом 5 хвилин при кімнатній температурі з подальшим обробкою ультразвуком при 4 ° C. Зразки цитозольних білків, отримані центрифугуванням при 18000 g протягом 5 хвилин при 4 ° C, розділяли на 12% SDS -поліакриламідний гель-електрофорез при 180 В протягом приблизно 1 години і переносили в 0,45 мкм нітроцелюлозні мембрани, які блокувались на 5%. Живуть у сольовому розчині, забуференному Тріс, рН 7,5, при 4 ° С протягом ночі. Як первинні, так і вторинні антитіла використовували у розведенні 1: 1000. Інкубація проводилась протягом 1 години при кімнатній температурі, а розвиток посилювався хемілюмінесценцією. Плямки сканували за допомогою денситометра, щоб кількісно визначити відмінності.
Статистичний аналіз
Результати повідомляються як середнє значення ± sem для щонайменше трьох повторюваних експериментів. Відмінності у складах між групами визначали шляхом одностороннього дисперсійного аналізу з подальшим кількома порівняльними тестами Тукі-Крамера. Значення P 23, що вказує на роль шляху ERK в його індукції. Подібні результати були отримані щодо експресії білка ATGL, яка була подвоєна як ZAG, так і ізопротеренолом, і це було повністю ослаблено PD98059 (рис. 1е), знову вказуючи на роль ERK. PD98059 ослабив ліполіз, індукований в ізольованих адипоцитах ZAG і, меншою мірою, ізопротеренолом, хоча він не повернувся до основних значень (рис. 1f). Ці результати дозволяють припустити, що шлях ERK бере участь у підвищеній експресії білків HSL та ATGL у WAT. 24, 25 
Ліполітична активність ZAG в адипоцитах, виділених від худих і ob/ob мишей, людських адипоцитах та вплив ZAG на експресію HSL. a ) Індукція ліполізу в епідидимальних адипоцитах миші з худих (▪) та об/об ( □ ) миші з ізопротеренолом або ZAG у концентраціях, зазначених протягом 2 годин. Повідомляється, що відмінності від худорлявих тварин * P ** P *** P) порівняно з базальними рівнями (▪). Відмінності від адипоцитів епідидиму у ( a ) повідомляються як ** P ** P *** P *** P † P †† P 15 Збільшення маси тіла розглядалося як збільшення маси м’язів шлунково-кишкового тракту, хоча ніякого впливу на вагу м’яза підошви не було. BAT був майже вдвічі (PBS 0,42 ± 0,12 г, ZAG 0,79 ± 0,66 г; рівень глюкози та інсуліну Р15 у плазмі крові був знижений, як і рівні неестерифікованих жирних кислот та тригліцеридів, тоді як рівні гліцерину були зменшені). подібно до того, що відбувся через 5 днів після введення ZAG, і виведення глюкози з сечею також було зменшено (рис. 2в), але основне зниження відбулося в перші 5 днів після введення ZAG, після чого рівні залишалися постійними.
Вплив ZAG на масу тіла, температуру та екскрецію глюкози з сечею у мишей ob/ob. a ) Вплив ZAG (100 мкг; внутрішньовенно, ▪) або PBS (♦) на масу тіла мишей ob/ob протягом 15 днів. Дні, коли ZAG не вводили, позначені ↑. ( b ) Ректальна температура об/об мишей, оброблених PBS (♦) або ZAG (▪), як описано в ( a ). ( c ) Виведення з сечею мишей ob/ob, яким вводили PBS (♦) або ZAG (▪) протягом 15 днів. Відмінності від контролю PBS повідомляються як * P
Експресія HSL та ліполітична відповідь адипоцитів від мишей ob/ob, яким вводили ZAG. ( a ) Вестерн-блот показує експресію ZAG в епідидимальної (еп), підшкірній (sc) та вісцеральній (віс) жировій тканині мишей ob/ob через 5 днів безперервного введення ZAG (35 мкг; внутрішньовенно щодня). Актин служив контролем навантаження. ( b Адипоцити (ep) видаляли у мишей наприкінці 5 днів лікування (день 0) і витримували в середовищі RPMI 1640, що містить 10% плодової телячої сироватки у відсутність ZAG, ще 4 дні. Експресія ZAG визначалася вестерн-блот. ( c ) Вестерн-блот показує експресію фосфо-HSL в адипоцитах безпосередньо після видалення від мишей (день 0) та ще через 4 дні в культурі тканин за відсутності ZAG. ( d ) Ліполітична відповідь епідоцитів in vitro у мишей ob/ob, які отримували PBS (▪) або ZAG (in vitro).
Експресія білків HSL, ATGL та фосфо ERK у мишей WAT ob/ob, оброблених ZAG. Вестерн-плями, що демонструють експресію HSL ( a ), ATGL ( b ) та фосфо ERK ( c ) у епідидимальних (ep), підшкірних (sc) та вісцеральних (vis) адипоцитів, видалених з мишей ob/ob, які отримували або PBS, або ZAG (35). внутрішньовенно) протягом 5 днів. Денситометричний аналіз представляє середнє значення для трьох окремих ляп. Відмінності від тварин, оброблених PBS, повідомляються як * P
Швидкість втрати радіоактивності від епідидиму ( a ) [U-14C] мічений пальмітат епідидималь, ( b ) підшкірно, c ) брижові (вісцеральні) жирові прокладки об/об мишей після обробки ZAG (50 мкг; внутрішньовенно); iv) щодня) (▪) або PBS (♦) протягом 5 днів. ( d ) накопичення [U-14C] пальмітату в різних органах через 1 годину після безпосереднього введення в епідидимальні жирові прокладки мишей ob/ob після введення будь-якого ZAG (50 мкг; в/в на день) ( □ ) або PBS (▪). Повідомляється про відмінності від контролю PBS, як * P ** P 14 C] пальмітик від епідидимальних жирових відкладень також корелював би з підвищеною ліполітичною реакцією на ZAG (рис. 1а) порівняно з підшкірними та вісцеральними адипоцитами (рис. 1b). Цей ефект також спостерігається з агоністом β3-AR, BRL 37344 (рис. 6а), який спричинив посилену стимуляцію ліполізу в адипоцитах епідидиму у тварин, які отримували ZAG, тоді як у підшкірних та вісцеральних адипоцитах попередня обробка ZAG не впливала на ліполітичні відповідь. Ці результати свідчать про те, що ZAG може діяти синергетично з агоністами β3-AR для мобілізації ліпідів. Сенсибілізація адипоцитів до BRL 37344 також спостерігалася в короткочасній культурі через 2 години інкубації із ZAG, але не із ізопротеренолом (рис. 6b).
Спочатку вважалося, що HSL є ферментом, що обмежує швидкість, але останні дані 35 свідчать про те, що ATGL може бути обмежуючим фактором. Як і у випадку з HSL, 13 рівнів ATGL у підшкірній жировій тканині у людей з ожирінням було показано, що вони знижені, незважаючи на підвищену експресію мРНК, 36 хоча в інших дослідженнях 37, 38 повідомляється про зменшення як мРНК HSL, так і ATGL і білка. Існує значна кореляція між експресією мРНК ATGL та HSL як у вісцеральній, так і в підшкірній жировій тканині, що вказує на загальний механізм регулювання їх експресії. 37, 38 Це може бути пов'язано з активацією шляху ERK, як повідомляється в дослідженнях in vitro, оскільки ERK активувався у всіх складах жирової тканини після введення ZAG мишам ob/ob. Показано, що як резистентність до інсуліну, так і гіперінсулінемія у людей із ожирінням корелюють з експресією білка ATGL і HSL, незалежно від маси жиру. Таким чином, здатність ZAG підвищувати експресію як HSL, так і ATGL буде корелювати з його здатністю полегшувати резистентність до інсуліну15, хоча інші механізми, такі як посилене поглинання та окислення глюкози та жирних кислот, швидше за все, є більш важливими.
Лікування мишей ob/ob ZAG також збільшувало експресію білка ZAG в епідидимальній, підшкірній та вісцеральній жировій тканині. Хоча експресія ZAG низька при ожирінні, 7, 8, 9, було показано, що її експресія в WAT збільшилась у 10 разів у мишей кахексії. Доведено, що це пов’язано зі збільшенням сироваткового кортизолу 39, хоча показано, що фактор некрозу пухлини-α некротизуючий фактор призводить до 4-кратного зменшення експресії ZAG у синдромі Сімпсона-Голабі-Бемеля у 40 адипоцитах людини потенційний механізм пояснення низьких рівнів ZAG, виявлений у жировій тканині людей із ожирінням. Показано, що індукція ZAG в адипоцитах 3T3-L1 введенням екзогенного ZAG послаблюється селективним антагоністом β3-AR SR59230A, що припускає, що він опосередковується β3-AR. 39
ZAG може бути необхідним для оптимального ефекту p3-AR, оскільки миші-нокаути ZAG демонстрували нижчу відповідь на специфічний агоніст β3-AR CL316243. Оскільки рівні ожиріння ZAG низькі при ожирінні, експресія 7, 8, 9, p3-AR також може бути неоптимальною. Таким чином, агоністи p3-AR можуть вимагати оптимальної активності ZAG, про що свідчить посилений ліполітичний ефект ізопреналіну та BRL 37344 в адипоцитах від мишей ob/ob, що отримували ZAG. Крім того, багато ефектів ZAG на діабет у цій моделі 15, ймовірно, пов'язані з його активністю 3-AR-агоніста. Агоністи 16p3-AR індукують ліполіз у ВАТ через класичний циклічний АМФ та шлях протеїнкінази А, а також через шлях ЕРК, на який припадає 15-25% загального ліполізу. 32
Адипоцити мишей, що страждають ожирінням, також експресують у 2 рази нижчі рівні гамми, стимулюючої субодиниці білка, що зв’язує гуанозин трифосфат, який стимулює аденилілциклазу. Показано, що ZAG підвищує експресію Gαs і зменшує експресію інгібуючого G-білка Gαi в адипоцитах 3T3, 43 пропонуючи механізм, за допомогою якого ZAG може посилювати ліполітичну відповідь на додаток до індукції HSL та ATGL.
Ці результати вказують на те, що ZAG спричиняв значне зменшення жирової маси у мишей ob/ob. Ефект проявлявся через ліполітичну активність разом із індукцією експресії білка HSL та ATGL в адипоцитах, що могло спричинити сенсибілізацію до інших ліполітичних стимулів. Крім того, вивільнені ліпіди будуть перетворюватися в тепло завдяки збільшенню маси НДТ. Ці результати дозволяють припустити, що ZAG може подолати деякі метаболічні зміни, пов'язані зі станом ожиріння. Подальші дослідження будуть досліджувати роль β-адренергічних рецепторів у дії ZAG.