Mar’a Luisa Mansego, Marian Zulet, Javier Campi - n J, Ferm’n Milagro F, JosЋ Alfredo Mart’nez *

CIBER CB06/03 Фізіопатологія ожиріння та харчування, (CIBEROBN), Інститут Салуда Карлоса III, Мадрид, Іспанія та Центр досліджень у галузі харчування та Департамент харчових наук та фізіології а, Університет Наварри. C/Irunlarrea 1, Памплона, Наварра 31008, Іспанія

після

Отримано 8 квітня 2014 р. An. Real Acad. Ферма. Том 80, Nј 3 (2014), сторінки 614-623

За допомогою епігенетичного підходу було проаналізовано можливі зв’язки між базальними рівнями метилювання ДНК та кращою реакцією на втрату ваги після програми харчових втручань серед населення з ожирінням у Сполучених Штатах. Це дослідження виявило 3 ділянки ДНК (гени RGS6, A2BP1 та RASGRF1), які диференційовано метилюються між суб’єктами з високою та низькою реакцією на втрату ваги. Крім того, ці гени беруть участь в одному і тому ж метаболічному шляху і раніше були суттєво пов’язані з ожирінням.

Ключові слова: Метилювання ДНК; харчове втручання; втрата ваги .

Дослідження епігеномної асоціації при втраті ваги після дієтичного втручання: дослідження RESMENA

За допомогою підходу анепігеноміки можливе зв’язок між базовими рівнями метилювання ДНК та кращою реакцією на зниження ваги після мультидисциплінарної програми втручання було проаналізовано у популяції ожиріння з дослідження RESMENA-S. Три області ДНК, які диференційовано метильовані (RGS6, A2BP1 і RASGRF1 гени) показали диференціальні рівні метилювання на вихідному рівні між високими та низькими реакціями на мультидисциплінарне втручання у зниженні ваги. Більше того, ці гени були залучені в один і той же метаболічний шлях і раніше були суттєво пов'язані з ожирінням.

Ключові слова: Метилювання ДНК; харчове втручання; втрата ваги .

Основними епігенетичними процесами, які можуть вплинути на розвиток ожиріння, завдяки його ролі в регуляції експресії пов’язаних з ним генів, є метилювання ДНК на островах CpG, ковалентні модифікації хвостів гістонів метилуванням, ацетилюванням або убіквітінацією та регуляторні білки, які підтримують хроматин в активному (триторакс) або мовчазному (полікомби) стані (6). Деякі автори також включають мікроРНК (miРНК) як елементи епігенетичної регуляції або тому, що вони контролюють експресію важливих епігенетичних регуляторних генів, таких як гистоновие ацетилази або ДНК-метилтрансферази, а також через епігенетичний контроль експресії. N деяких мікроРНК (23) .

Деякі метаболічні зміни, пов'язані з ожирінням, такі як гіперглікемія та резистентність до інсуліну, а також наявність перспективних факторів у раціоні, таких як фолієва кислота або метіонін, мають вирішальний вплив на епігенетичні процеси, що впливають на гени, пов'язані з ожирінням ( 4). Крім того, на ці епігенетичні механізми впливають інші фактори, зазвичай пов’язані з ожирінням, включаючи запалення, через дію прозапальних цитокінів, таких як TNFα та IL-6 (27), окислювальний стрес (9) та гіпоксичні стани, що розвиваються у людей із ожирінням. жирова тканина (26). На всі ці модифікації можуть впливати різні явища навколишнього середовища, включаючи численні дієтичні фактори, і припускають, що вони можуть передаватися шляхом трансгенераційного епігенетичного успадкування (20). У цьому сенсі попереднє дослідження (19) пов’язує ожиріння у щурів, які харчуються дієтою з високим вмістом жиру у зрілому віці, із більшим метилюванням промотору лептину. Так само було показано, що ця дієта здатна змінити метилювання таких важливих генів, як синтаза жирних кислот (FAS) або мітохондріальний ген NDUFB6 (15). .

Тому наша мета полягала у дослідженні можливих змін у моделях метилювання ДНК серед осіб, які показали високу або низьку реакцію на комплексну програму зниження ваги у пацієнтів із ожирінням.

2. матеріал і методи

Вивчити популяцію та експериментальний дизайн

Дослідження зменшення метаболічного синдрому в Наваррі-Іспанії (RESMENA-S) є мультидисциплінарною стратегією, заснованою на хроноживленні та харчовій освіті, разом з дієтичним та психологічним контролем, яке складалося з рандомізованого дослідження паралельного та перспективного дизайну, в якому брали участь 100 осіб. (28). Група RESMENA-S (n = 50) дотримувалась персоналізованої дієти для схуднення (обмеження енергії на 30%), з розподілом макроелементів (вуглеводи/жири/білки) 40/30/30, висока частота прийому (7/день), низький глікемічний індекс/навантаження та висока антиоксидантна здатність та дотримання середземноморської дієти (28). Контрольна група (n = 50) дотримувалась дієти з однаковим обмеженням енергії на основі Американської асоціації серця (AHA). Дослідження тривало 8 тижнів під дієтичним та психологічним контролем в обох групах. Протягом додаткових 16 тижнів самоконтролю добровольці дотримувались тієї ж дієтичної схеми, але без особливих консультацій.

Дослідження рівня метилювання проводили на підбірці з 46 осіб із ожирінням (50% чоловіків). Ці учасники були відібрані із загальної вибіркової сукупності, і ті, хто мали кращу чи гіршу реакцію на втручання у схуднення. Їх розглядали як "високу реакцію" (втрата більше 5% від початкової ваги після 24 тижнів втручання; n = 26) та "низьку реакцію" (тих, хто не досяг втрати своєї 5% ваги; n = 17 ), відповідно.

Усі випробовувані дали письмову інформовану згоду (http://www.clinicaltrials.gov; NCT01087086), дослідження було схвалено Комітетом з етики Університету Наварри (065/2009) та погоджено з Декларацією від Гельсінкі (переглянуто) у Південній Кореї у 2008 р.).

Антропометричні та біохімічні оцінки

Антропометричні вимірювання (вага, зріст, обхват талії та стегон) проводили з випробовуваними в нижній білизні. Вагу тіла вимірювали з точністю до 0,1 кг за допомогою Tanita SC-330 (Tanita Corp, Японія). Висоту оцінювали за допомогою вимірювача висоти (модель Seca 713, Postfach, Німеччина) з точністю до 1 мм. Індекс маси тіла (ІМТ) розраховували як масу тіла, поділену на зріст у квадраті (кг/м 2). Окружність талії та стегон вимірювали згідно затверджених протоколів (28). Загальний жир в організмі вимірювали за допомогою біоелектричного імпедансу Tanita SC-330 (TanitaCorp, Японія) та за допомогою подвійної енергетичної рентгенівської абсорбціометрії (DXA) (Prodigy, версія програмного забезпечення 6.0, Madison, WI), як описано раніше (28) .

Концентрації глюкози, загального холестерину, ліпопротеїдів-холестерину високої щільності (HDL-c) та тригліцеридів у сироватці крові вимірювали в автоаналізаторі Pentra C-200 (HORIBA ABX, Мадрид, Іспанія) із зазначеними наборами. Концентрації інсуліну визначали за допомогою набору для імуноферментного аналізу (Mercodia, Уппсала, Швеція) на автоаналізаторі Triturus (Grifols SA, Барселона, Іспанія).

Вилучення ДНК

На початку дослідження відбирали зразки венозної крові для отримання ДНК. Генетичну ДНК витягували за допомогою набору для очищення ДНК. Master Purefor Blood Версія II (Epicenter Biotechnologies, штат Медісон, штат Вісконсин, США) та зберігається при -80 ° C до обробки.

Визначення моделей метилювання ДНК

Епігенетичний профіль генетичної ДНК аналізували у 48 осіб, відібраних у дослідженні RESMENA-S, використовуючи аналіз людського метилювання 450 BeadChip (Illumina, Сан-Дієго, Каліфорнія), що містить понад 485 000 окремих сайтів CpG. Коротко кажучи, 500 нг генетичної ДНК, обробленої бісульфітом натрію (EZ DNA Methylation Kit; Epitect, Qiagen), підсилювали, мітили, гібридизували з метильованими та неметильованими зондами та сканували мікрочипи на платформі HiScanSQ від Illumina, Inc. Аналіз та визначення зображень сигналу зондів проводили за допомогою програмного забезпечення Genome Studio, модуля метилювання (Illumina, Inc).

Дані метилювання на конкретному сайті CpG були отримані з інтенсивності сигналу для метильованого (M) та неметильованого (U) зонда для генетичної ДНК у цій позиції. Таким чином, рівні метилювання (β) розраховували як частку метилювання відносно загального сигналу [тобто β = M/(M + U)], де діапазон β коливається від 0 (неметильований) до 1 (метильований).

Аналіз метаболічного шляху проводили за допомогою аналізу шляху винахідливості (IPA; Ingenuity Systems, Inc., Редвуд-Сіті, Каліфорнія, США; http://www.ingenuity.com), включаючи точні та простежувані вручну дані, повністю отримані з бібліографічних джерел.

Статистичний аналіз проводили із використанням статистичного пакету SPSS 15.0 (SPSS, Чикаго, Іллінойс, США). Для визначення нормальності змінного розподілу використовували тести Колмогорова-Смірнова та Шапіро-Вількса.

Відмінності в клінічних та антропометричних параметрах після втручання між дієтами з високим та низьким ступенем реагування оцінювали за допомогою тесту Стьюдента або U-тесту Манна Уїтні. Графік вулканів та різницю між різними сайтами CpG оцінювали за допомогою одностороннього ANOVA (відповідь на ефект дієти з урахуванням віку та ефект від використання різних мікрочипів) завдяки програмі Array Studio 5.0 (Om Componentes, Cary, Північна Кароліна, США). Швидкість помилкового виявлення (FDR) застосовувалась при коригуванні для кількох порівнянь.

3. результати та обговорення

Цей проект був зосереджений на відборі осіб, які брали участь у дослідженні RESMENA-S до його завершення. Загальні характеристики учасників, згруповані відповідно до їх реакції на дієтичне втручання, суттєво не відрізнялись між суб'єктами контрольної групи та RESMENA-S за антропометричними змінними, артеріальним тиском та ліпідним профілем (таблиця 1). Однак особи з високою реакцією на дієту продемонстрували значне зниження більшості антропометричних параметрів відносно їх початкових значень.

Щодо результатів, отриманих у мікрочипі BeadChip людини Methylation450, після аналізу контролю якості згаданого масиву зразок зменшили до 46 досліджуваних. Ділянка вулкана показала розподіл 485 512 місць CpG, проаналізованих щодо реакції на втрату ваги внаслідок дієти (рис. 1). Дослідження мікрочипів показало 90 диференційовано метильованих сайтів CpG (P-значення

Таблиця 1.- Клінічні характеристики 46 пацієнтів із ожирінням на початковому рівні та після 24 тижнів дієтичного втручання у популяції RESMENA-S.