дослідження

  • реферат
  • Головний
  • методи
  • Пацієнти.
  • Збір тканин.
  • Кількісна RT-PCR.
  • Визначення HLA.
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • ОБГОВОРЕННЯ
  • глосарій

реферат

Під час вагітності між матір’ю і плодом проходить невелика кількість клітин, і це перенесення може призвести до химерного стану, який зберігається роками у обох особин. Як мікроімімеризм плода, так і матері (MMc) були пов’язані з різними аутоімунними порушеннями. Інформація про MMc у тканинах здорових людей є рідкісною, але важлива при пошуку материнських клітин у уражених тканинах певних захворювань. Метою цього дослідження було дослідити наявність материнських клітин у мигдалинах та аденоїдах 20 здорових дітей у віці від 2 до 15 років. Всім дітям зробили операцію з приводу періодичної ангіни або закупорки дихальних шляхів. MMc було виявлено методом RT-PCR на основі відмінностей у поліморфізмах генів між матір’ю та дитиною. У чотирьох із 20 дітей ми виявили материнські клітини в мигдалинах та/або аденоїдах. Ця частота нижча, ніж частота материнських клітин, виявлених у периферичній крові здорових дорослих, але узгоджується з раніше повідомленою частотою химеризму матері у контрольних тканинах.

Головний

Двоспрямоване проходження клітин матері та плоду через плаценту може призвести до химерного стану, який роками зберігається у матері та її потомства (1, 2). Функція та значення цих напівалогенних клітин невідомі. Хоча наслідки фетального мікрохімеризму (невелика кількість клітин плоду у матері) невідомі, вважається, що клітини плоду беруть участь у спрацьовуванні аутоімунних розладів (3-7) або виступають як омолоджуюче джерело, яке бере участь у процесах відновлення тканин. (8, 9). Інші звіти вказують на химерні клітини плода як на "невинних спостерігачів" у запальних або загоєнних процесах (10).

Передача невеликої кількості стовбурових клітин нащадкам під час вагітності, мікробімеризм матері (MMc), вивчався в меншій мірі, ніж мікрохімеризм плода. Клітини матері виявляли при різних концентраціях крові плода з 13 (11) тижня та до 100% у зразках пуповинної крові в залежності від методу, що використовується для виявлення материнських клітин (12-14).

Нещодавно ми повідомляли про виявлення імунокомпетентних клітин матері у 11-х триместральних плодів (15), які були перервані через вади розвитку та/або трисомію 21 або з соціальних причин. Клітини матері були знайдені у семи з 11 плодів, і ці клітини виражали поверхневі маркери для Т- та В-лімфоцитів, лейкоцитів та гемопоетичних клітин-попередників. Клітини матері були присутні у всіх обстежених органах і були виявлені у нормальних плодів та у плодів з вадами розвитку та/або трисомією 21.

Далі, Стівенс та ін. (16) нещодавно показали, що материнські клітини були присутні в різних типах тканин у семи немовлят чоловічої статі. Вони також показали, що материнські клітини диференціюються на конкретні типи клітинних органів. Мелоні та ін. (2) продемонстрували, що клітини матері були присутніми в крові здорових людей середнього віку.

Як і при мікрохімеризмі плода, потомство материнських клітин асоціюється з різноманітними аутоімунними захворюваннями, особливо станами, які трапляються у дітей (17–25). Оскільки доля цих напівалогенних стовбурових клітин в значній мірі невідома, особливо в тканинах здорових людей, ми прагнули визначити, чи були стовбурові клітини присутніми в лімфоїдних тканинах дітей протягом дитинства, намагаючись з’ясувати потенційну роль MMc в імунних розвитку. У попередніх дослідженнях ми продемонстрували присутність зрілих материнських Т і В-клітин, а також гемопоетичних попередників у різних тканинах плода. У цьому дослідженні ми досліджували MMc у мигдалинах та аденоїдних тканинах, які від природи багаті лімфоїдними клітинами і навіть можуть представляти потенційний сайт постнатального лімфопоезу (26).

методи

Пацієнти.

Проби тканин мигдаликів та/або аденоїдів 20 дітей, які перенесли тонзилектомію та/або аденоїдектомію, були взяті проспективно. З літератури та попередньої роботи ми базувались на 30% поширеності MMc у різних тканинах. Тому ми припустили, що 20 випадків повинні забезпечити вибірку для тестування на наявність материнських клітин у мигдалинах та аденоїдних тканинах нащадків.

Показанням до хірургічного втручання була обструкція дихання (хропіння) та/або рецидивуючий тонзиліт (табл. 1). Матері дитини була надана анкета про стан здоров'я матері та дитини. Питання включали тривалість періоду грудного вигодовування, історію матері у матері, чи переливались матері чи дитині кров і чи були мати чи дитина двійнятами. Характеристики дітей та їх матерів наведені в таблиці 1. Жоден з дітей або матерів не був близнюками і не отримував переливання крові, і всі учасники були здоровими, за винятком однієї матері з гіпотиреозом та однієї з фіброміалгією. Історія пологів у дітей була нормальною у всіх випадках, за винятком одного випадку, коли дитина народилася на 33-му тижні вагітності через розрив плаценти (випадок 17).

Стіл в натуральну величину

Збір тканин.

Периферичну кров збирали у матерів та дітей. У дітей мигдалини та аденоїди видаляли кюретажем під загальним наркозом і відразу після операції направляли на розтин та подальший аналіз у патологічне відділення.

Тканини промивали стерильним сольовим розчином і розрізали в стерильних умовах. Кожен мигдаль був розділений на дві половини. Шматок тканини розміром приблизно 5 х 5 х 5 мм брали з кожної половини для ПЛР-аналізу. Таким чином, загалом чотири фракції від кожної пари мигдалю (позначених від Т1 до Т4) були включені в аналіз. Ці фракції збирали з центральної області мигдалини, щоб запобігти забрудненню епітеліальними клітинами та можливим запальним ексудатом на поверхні крипт. Подібним чином аденоїд поділяли на дві половини, і з кожної половинки для аналізу ПЛР видаляли невеликий (середній) шматочок тканини. Гістопатологічне дослідження тканин не проводилось. Це дослідження було схвалено Комітетом з етики Університетської лікарні в Кароліні (Dnr 2008/3: 3). Схвалення Інституційної комісії з огляду було отримано від усіх пацієнтів.

Кількісна RT-PCR.

ДНК із зразків крові, мигдалю та аденоїдів витягували за допомогою міні-набору Qiagen (Qiagen, Hilden, Німеччина). Концентрацію тканинної ДНК спочатку розбавляли до 100 нг/мкл, отримуючи в цілому 500 нг у кожній реакції ПЛР.

Специфічність та чутливість методу RQ-PCR була визначена для всіх маркерів, включених у це дослідження, з використанням штучних сумішей ДНК та змінної кількості ДНК. Аналіз ПЛР підтверджували змішуванням ДНК від однієї особини (позитивної для трьох маркерів) при різних концентраціях у іншої особи (негативної для маркерів). Загальна кількість ДНК становила 500 нг, що було продемонстровано стабільним значенням Ct для GAPDH (дані не наведені). Використовуючи 500 нг ДНК та 40 циклів ампліфікації ПЛР, ми не виявили помилково позитивних результатів.

Визначення HLA.

Поліморфізми HLA-A, -B та -DRB1 визначали із застосуванням стандартних методів, заснованих на ПЛР (LabType, One Lambda, Inc, CA), включаючи специфічні для послідовності олігонуклеотидні зонди (PCR-SSOP) з використанням технології xMAP (Luminex System, Luminex Corporation, Остін)., Техас).

РЕЗУЛЬТАТИ

Клітини матері були виявлені у чотирьох із 20 дітей (табл. 2). Діти, які позитивно оцінили MMc у мигдалинах та/або аденоїдах, були двома хлопцями (випадки 9 та 15) та двома дівчатками (випадки 10 та 14) у віці від 4 до 6 років. Випадки 9 та 14 були позитивними у всіх фракціях тканин, а також у крові. Випадок 10 був позитивним для стовбурових клітин у всіх тестованих фракціях, за винятком однієї з мигдалин (Т4) та двох аденоїдних фракцій. Випадок 15 був позитивним лише в одній з чотирьох фракцій мигдалю та крові. Також виявлено, що всі випадки MMc-позитивні в крові позитивні в мигдалинах або аденоїдних тканинах приблизно з подібною швидкістю. Детальні дані RT-PCR для зразків MMc наведені в таблиці 3. Очевидної кореляції між наявністю материнських клітин у мигдалинах та/або аденоїдах та різними комбінаціями класів HLA для матері та дитини не виявлено (дані не наведені).

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

ОБГОВОРЕННЯ

Це дослідження підтверджує попередні повідомлення про те, що MMc є відносно поширеним явищем. Більшість досліджень оцінювали частоту MMc у пацієнтів з різними захворюваннями, хоча повідомляється про обмежену інформацію про MMc у здорових людей, особливо в тканинах. У другому триместрі, плодам із соціально мотивованих закінчень, ми змогли виконати MMc в різних органах приблизно в 50% випадків з 13-го тижня вагітності (15). Цвіль та ін. (29) повідомили про ще більші значення MMc у лімфатичних вузлах плода, отриманих під час абортів у другому триместрі. У 100% всіх немовлят при народженні є материнські клітини в пуповинній крові (12–14), і передбачувана частота материнських клітин становить від 0,02 до 5% (9, 11, 12). Дані MMc після пологів в основному базуються на зразках крові. MMc може зберігатися до середнього віку, і залежно від методу, який використовується для виявлення, значення MMc коливаються від 20 до 39% у різних популяціях клітин периферичної крові (30). Таким чином, MMc видається загальним і зберігається протягом багатьох років.

Інформація про кількість і розподіл материнських химерних клітин в органах і тканинах здорових особин може мати вирішальне значення для розуміння потенційної фізіологічної ролі цих клітин; однак дуже мало досліджень розглядало це питання. Результати цих звітів узагальнені в таблиці 4. При дослідженнях абортів, біопсії та розтину тканин MMc виявляли в різних тканинах, таких як шкіра, серце, печінка, селезінка, тимус, щитовидна залоза та підшлункова залоза. (15–25, 29, 30, 31), і жоден конкретний орган не мав явної схильності до MMc. Ці звіти широко варіюються з точки зору частоти MMc та частотних посилань від 0 до 100%, хоча на достовірність опублікованих результатів впливало кілька обмежень. У багатьох випадках матеріал пацієнта був обмеженим, а методи виявлення були дуже різними. Крім того, більшість контрольних груп, що використовувались у дослідженнях, були пацієнтами із серйозним захворюванням певного органу (тобто шкіри, м'язів, печінки тощо), а не здоровими особами.

Стіл в натуральну величину

Це дослідження є першим звітом про MMc у мигдалинах та аденоїдній тканині. Наше дослідження цих тканин було частково засноване на тому, що ми змогли вивчити материнські клітини в лімфоїдних органах, які легко доступні в тканинах відносно здорових дітей. Мигдаль та аденоїдні тканини розвиваються після народження і являють собою першу лінію захисту від мікробної інвазії у верхню аеро-травну систему. Імунологічні процеси, пов'язані з лімфоцитами В і Т, ініціюються в різних спеціалізованих відділах піднебінних мигдалин (32, 33). Аденоїд також є активним імунологічним сайтом в області носоглотки, який несе клітини як вродженої, так і адаптивної імунної системи (34, 35).

Тут ми проаналізували свіжу тканину з акцентом на непоширені материнські поліморфні області в екстрагованій ДНК. У нашому дослідженні було кілька обмежень. Хоча ми виявили MMc у 20% випадків, кількість пацієнтів, включених у дослідження, була обмеженою. Далі, за погодженням з Alizadeh et al. (27), чутливість методу химеризму RQ-PCR становить 0,01% для більшості маркерів. Нижче 0,1%, лінійність методу порушується, але чутливість може бути до 0,01%. Рівень химеризму матері різний у різних осіб, і хоча цей метод був дуже чутливим, ще більш чутливий метод може дати більше позитивних випадків.

Таким чином, теоретично цей метод може недооцінювати MMc. Крім того, оскільки ми не проводили жодного аналізу in situ, ми не могли оцінити анатомічне розташування та інтеграцію цих клітин. Тому ми не можемо стверджувати, що материнські клітини інтегровані в тканину мигдаликів або що ці клітини циркулюють у дрібних судинах, пов’язаних з криптами мигдаликів. Ці проблеми вимагають подальших досліджень, що поєднують імуногістохімію з іншими методами ідентифікації клітин матері, такими як гібридизація in situ для хромосом X та Y. Подібним чином, хоча наші дані свідчать про хорошу кореляцію між MMc у крові та мигдалиновій тканині, проблема не була вирішена, оскільки не надають доказів трансплантації химерних клітин матері.

Залишаються питання щодо того, чому MMc зберігається у деяких осіб, незважаючи на відмінності HLA між матір’ю та дитиною. Механізм, за допомогою якого плід розпізнає і переносить материнські клітини, невідомий, але ймовірно, що поглинання материнських клітин є функцією незрілої імунної системи майбутньої дитини. У цьому дослідженні ми не змогли продемонструвати жодної очевидної взаємозв'язку між типами матері та дитини HLA та наявністю MMc; Однак порівняно обмежений матеріал у нашому дослідженні не дав остаточної відповіді щодо того, чи може сумісність HLA між матір'ю та дитиною впливати на зовнішній вигляд (або тип) MMc.

Іншим міркуванням при роздумах про функцію материнських клітин є те, чи здатні ці клітини продемонструвати пластичність клітин. Стівенс та ін. (19) У дослідженнях MMc міокарда у дітей із синдромом вовчака новонароджених було показано, що материнські клітини диференціюються в серцеві міоцити. У наших попередніх дослідженнях ми показали, що клітини CD 34+ і CD 45+ можуть передаватися через плаценту від матері до плоду. Обидва ці типи клітин можуть виявляти пластичні властивості (41).

Іншим міркуванням при роздумах про функцію материнських клітин є те, чи здатні ці клітини продемонструвати пластичність клітин. У наших попередніх дослідженнях ми показали, що клітини CD 34+ і CD 45+ можуть передаватися через плаценту від матері до плоду. Ці клітини експресують клітинний маркер для попередників гемопоетичних та ендотеліальних клітин. Стівенс та ін. (19) вивчали подібні клітинні маркери в серцевій тканині дітей із неонатальною вовчаком та вродженою серцевою блокадою та показали, що 86% материнських клітин, знайдених у міокарді, також експресують саркомерний α-актин, специфічний маркер кардіоміоцитів. Таким чином, материнські клітини в тканинах нащадків виявляють пластичність. Ця природна пластика може зіграти важливу роль у впливі на матір та її потомство. Цей механізм може також пояснити, як набуті здібності, корисні та/або згубні для дитини, можуть передаватися від одного покоління іншому як епігенетичний ефект.

На закінчення, MMc виявлено у 20% зразків мигдалин та аденоїдної тканини у здорових дітей у віці від 2 до 15 років. Наскільки нам відомо, це дослідження є першим, що вивчає MMc у цих тканинах. Оскільки ці органи відіграють центральну роль в імунній регуляції дитини, що розвивається, необхідні подальші дослідження для вивчення біологічних ефектів MMc у цих тканинах.