ендоканабіноїди

  • предметів
  • реферат
  • цілі:
  • Предмети та методи:
  • результати:
  • висновок:
  • вступ
  • Предмети та методи
  • предметів
  • Культура клітин або жиру
  • Вилучення РНК та кількісна ПЛР у реальному часі (RTQ-PCR)
  • Визначення концентрації ApN у середовищі за допомогою АРВ
  • імуноаналіз цАМФ
  • Вестерн-блот
  • Презентація результатів та статистичний аналіз
  • результат
  • Вплив блокади CB1R на експресію гена адипокіну в культивованих експлантатах
  • Вплив блокади CB1R на адипокіни у зрілих адипоцитах та SVC
  • Механізми, що беруть участь у регуляції ApN ES
  • обговорення

предметів

  • Регуляція генів
  • Ожиріння
  • Пептидні гормони

реферат

цілі:

(1) Дослідити, чи модулює канабіноїдний рецептор типу 1 (CB1R) безпосередньо регулює вироблення адипонектину (ApN) та інших адипокінів у жировій тканині жирової тканини (ОАТ) осіб, що страждають ожирінням, ефекти блокади виникають CB1R та (3) для виявлення основних механізмів.

Предмети та методи:

ОАТ отримували від 30 осіб із ожирінням (індекс маси тіла: 40, 6 ± 1, 3 кг м-2), які перенесли операцію на животі. Використовували первинні культури експлантів або свіжовиділених адипоцитів або стромальних судинних клітин (SVC).

результати:

У поясненнях OAT блокатор CB1R Rimonabant підвищував експресію гена ApN. Також був підвищений рівень мРНК оментину, який виявляє сенсибілізуючі властивості до інсуліну. На відміну від них, рівень мРНК двох прозапальних цитокінів, запального білка макрофагів (MIP) -1β та інтерлейкіну (IL) -7, був знижений. Подальше ми дослідили, де ці ефекти мали місце в рамках ОАТ. Експресія CB1R була однаковою в обох клітинних фракціях. В ізольованих зрілих адипоцитах блокада CB1R блокувала збільшення мРНК ApN та зменшення IL-7 мРНК, одночасно викликаючи збільшення секреції ApN у середовищі. В ізольованому SVC експресія гена оментину, яка обмежена цією фракцією, була збільшена, тоді як експресія MIP-1β була зменшена. Нарешті, ми розшифрували механізми, що призводять до регуляції ApN за допомогою ендоканабіноїдної системи (ES). Ми вперше виявили, що регулювання ApN фактично опосередковується CB1R: експресія гена ApN регулюється рімонабантом, а регулюється агоністом CB1R арахідоніл-2-хлоретиламідом (ACEA). Посилення регуляції ApN римонабантом не змінювалось інгібуванням продукції цАМФ. Однак зниження регуляції ApN за допомогою АСЕА було повністю скасовано за допомогою інгібітора протеїнкінази, активованого мітогеном p38 (p38MAPK), а АСЕА посилювало фосфорилювання p38MAPK.

висновок:

Блокада CB1R послаблює запальний стан в обох фракціях клітин OAT, або збільшуючи продукцію ApN та оментину, або зменшуючи MIP-1β та мРНК IL-7. ЄС регулювання ApN частково включає p38MAPK.

Ожиріння місцево характеризується запаленням жирової тканини та порушенням регулювання вироблення адипокіну з надмірною секрецією шкідливих регуляторних пептидів та гіпосекрецією захисних пептидів, таких як адипонектин (ApN). 1, 2 Така дисрегуляція викликає розвиток низькоякісного системного прозапального стану, який, як вважають, створює спільну основу для розвитку супутніх захворювань ожиріння та метаболічного синдрому. 1, 3, 4 Для цього несприятливого профілю здоров'я переважне накопичення центрального жиру, а не підшкірного жиру, виглядає як сильніший фактор ризику. 1

Ендоканабіноїдна система (ES), що складається з рецептора канабіноїдів 1 типу (CB1R) та лігандів, отриманих з ендогенних ліпідів, модулює енергетичний гомеостаз за рахунок центральних орексигенних ефектів та периферичних метаболічних ефектів на декілька органів, включаючи жирову тканину, де збільшується запас енергії. 5, 6 Люди з ожирінням демонструють вищий рівень ендоканабіноїдів у вісцеральному жирі та сироватці крові, ніж худі контролі 7, 8, а також вищий рівень ендоканабіноїдів у вісцеральному жирі, ніж у підшкірному жирі. 9 Потужна активація ЕК може розглядатися як рушійна сила, що веде до центрального ожиріння або пов’язана з ним. 10

Лікування пацієнтів із ожирінням селективним блокатором CB1R Rimonabant сприяло значному зменшенню маси тіла та окружності талії (показник ожиріння живота), а також покращенню серцево-судинних та метаболічних факторів ризику. 11 Деякі з цих поліпшень були пов'язані зі збільшенням рівня ApN в циркуляції. Це збільшення частково не залежало від втрати ваги і передбачало специфічне покращення функції жирової тканини. 12

Відповідно до цього спостереження, римонабант підвищував експресію ApN у жировій тканині гризунів, що отримували лікування in vivo, а також у мишачих лініях адипоцитів 3T3-F442A in vitro. Однак периферичні ефекти канабіноїдів були погано вивчені в жировій тканині людини. Кілька звітів дають суперечливі дані щодо вивільнення адипокіну з жирових клітин людини. 14, 15, 16 Ці експерименти проводили на адипоцитах, диференційованих in vitro від стромальних попередників, які були виділені в основному з підшкірного жиру осіб, що не страждають ожирінням, 15, 16 потім піддавали фармакологічним дозам адипогенних коктейлів. Однак сальникова, а не підшкірна жирова клітковина, а також ожиріння пов’язані з метаболічним синдромом та аномальним тоном ендоканабіноїдів. Крім того, диференціація адипоцитів у контексті in vivo разом із збереженими клітинними взаємодіями може бути необхідною умовою оптимальної експресії гена адипокіну. 17

На додаток до регулювання рівня ApN, ми показали, як і інші, що деякі адипокіни надмірно експресуються сальною жировою тканиною (ОАТ) осіб із ожирінням і можуть також сприяти метаболічним та серцево-судинним порушенням. 18 І адипоцити, і клітини стромальних судин (SVC, тобто нежирові клітини) сприяють дерегуляції адипокіну при ожирінні людини. 18 Однак потенційна пряма роль ЄК у Спільному центрі ніколи не розглядалась. Механізми, що лежать в основі потенційного регулювання адипокінів ЄС, все ще вивчаються.

Метою цього дослідження було (1) оцінити, чи регулює модуляція CB1R безпосередньо продукцію ApN та інших адипокінів в ОАТ у людей із ожирінням, (2) визначити, в якій клітинній фракції відбувається блокада OAT CB1R, та (3) розкрити основні механізми.

Предмети та методи

предметів

ОАТ отримували від 30 осіб із ожирінням, які перенесли баріатричну операцію (вертикальна стрічкова гастропластика) після нічного голодування (Таблиця 1). Пацієнтів не лікували гормонами (наприклад, глюкокортикоїдами; крім інсуліну для одного з них), нестероїдними протизапальними препаратами або іншими препаратами, які, як відомо, впливають на жирову масу або метаболізм (наприклад, тіазолідиндіони, системні та неспецифічні модулятори). адренергічні рецептори).

Стіл в натуральну величину

Перед операцією у кожного пацієнта брали кров. Як показано в таблиці 1, у цих пацієнтів було важке ожиріння, вони мали більш високий систолічний артеріальний тиск, рівень глюкози в крові натще, рівень холестерину ліпопротеїдів низької щільності та рівень С-реактивного білка, ніж рекомендовано або нормально, а жінки мали нижчий рівень холестерину ліпопротеїнів високої щільності . Вісім пацієнтів були діагностовані як діабетики 2 типу і лікувались дієтою та/або пероральними антидіабетиками або інсуліном для одного з них. Дві третини пацієнтів відповідали критеріям метаболічного синдрому, визначеним загальним науковим твердженням. 19

Для кожної культури використовувались пояснення або клітини лише одного суб’єкта. Через обмежену доступність тканин не всі дані можна отримати від усіх пацієнтів.

Протокол дослідження був затверджений місцевим комітетом з етики Cliniques Universitaires Saint-Luc.

Культура клітин або жиру

Ми використовували встановлені протоколи для вивчення продукування адипокінів фрагментами або ізольованими клітинами з ОАТ. 18, 20, 21 За цих експериментальних умов ані фракціонування тканин, ані культура як така не змінювали рівні експресії адипокіну. 18

Вилучення РНК та кількісна ПЛР у реальному часі (RTQ-PCR)

Загальну РНК з клітин або тканин екстрагували із застосуванням ізолюючого реагенту TriPure (Roche Diagnostics, Вільвурде, Бельгія). Загалом, 0,2-2 мкг загальної РНК транскрибували зворотним способом, як описано. Праймери RTQ-PCR були розроблені з використанням програмного забезпечення Primer Express (Applied Biosystems, Карлсбад, Каліфорнія, США; див. Таблицю 2). В цілому від 4 до 40 нг еквівалентів загальної РНК ампліфікували за допомогою iQSyber Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Назарет, Бельгія), що містить 200 нМ кожного конкретного праймера, використовуючи систему виявлення ПЛР iCycler iQ у реальному часі (Bio-Rad Laboratories) . Коротко кажучи, порогові цикли (КТ) вимірювались у двох примірниках. Значення ACT були розраховані для кожної проби для кожного гена, що нас цікавить, наступним чином: ген, що представляє інтерес, geneCT-репортерний ген з білком TATA, що зв’язує білок (TBP) як репортерний ген. Відносні зміни рівня експресії одного конкретного гена (ACT) обчислювали як ACt тестової групи мінус ACT контрольної групи, а потім представляли як 2-AAT (Delaigle et al. 26).

Стіл в натуральну величину

Визначення концентрації ApN у середовищі за допомогою АРВ

Концентрації ApN вимірювали в культивованому адипоцитарному середовищі за допомогою комерційно доступного набору RIA (Linco Research, Nuclilab, Нідерланди). Цей набір не розрізняє різні форми ApN. Зразки з розведеного середовища (1: 1) аналізували двічі.

імуноаналіз цАМФ

Концентрації CAMP у клітинах вимірювали за допомогою конкурентного набору ELISA (R&D Systems Europe Ltd., Абінгдон, Великобританія) відповідно до інструкцій виробника. Рівень CAMP нормалізувався до рівня клітинного білка, як визначено методом Бредфорда.

Вестерн-блот

Адипоцити гомогенізували в буфері лізису (Cell Signaling Technology, BIOKÉ, Лейден, Нідерланди), доповненому 1% коктейлем-інгібітором протеази (Roche Diagnostics). Загалом 20 мкг білків розчиняли в буфері Леммлі, піддавали SDS-PAGE в умовах відновлення та денатурації, а потім переносили на мембрани PVDF. Для імунодетекції використовували такі антитіла: анти-фосфо-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204), анти-фосфо-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) та анти-фосфо-p38MAPK (Thr180/Tyr182), Кожне антитіло було використано відповідно до інструкцій виробника (Cell Signaling Technology, BIOKÉ). Сигнали були виявлені при підвищеній хемілюмінесценції. Інтенсивності смуг визначали кількісно за допомогою скануючої денситометрії (Gel-Doc2000, Bio-Rad Laboratories, Ltd., Hemel Hempstead, Великобританія), аналізували за допомогою Quantum One (Bio-Rad Laboratories Ltd.) та нормалізували до смуги актину (Sigma-Aldrich, Bornem, Бельгія). інтенсивність.

Презентація результатів та статистичний аналіз

Результати представлені як середні значення ± sem для зазначеної кількості пацієнтів. Порівняння різних умов в одній групі проводили за допомогою двостороннього t-критерію Стьюдента (дві умови) або повторного дисперсійного аналізу (кілька умов), після чого, відповідно, тест Даннета або Ньюмана-Кілса. Різниці вважали статистично значущими при Р 27, вони також регулювались (приблизно + 78%; рис. 1). Далі ми досліджували вплив римонабанту на кілька інших адипокінів, раніше визначених як надпродукуючі ОАТ при ожирінні людини 18: три хемокіни (онкогенний фактор, пов’язаний із ростом, регульований після активації експресованих та секретованих нормальних Т-клітин, запальний білок макрофагів (MIP)). -1р), один інтерлейкін (ІЛ-7), один інгібітор тканинної металопротеїнази (ТІМП-1) та один фактор росту крові (тромбопоетин). Експресія гена MIP-1β та IL-7 регулювалася рімонабантом (приблизно -26% та приблизно -32% відповідно; P

Експресія генів адипокінів у експлантатах людського ОАТ, оброблених римонабантом. Екстрагенти людей з ожирінням ОАТ культивували з 10-100 нМ римонабантом (ободок) протягом 24 годин. Рівні мРНК адипокіну кількісно визначали за допомогою RTQ-PCR, нормалізували до рівнів TBP (використовували як репортерний ген) і представляли як відносну експресію порівняно з контрольними (необробленими) експлантатами. Результати середні ± sem для 8-12 осіб із ожирінням. * P 27, збільшився, як у TIMP-1, тоді як мРНК MIP-1β була зменшена (рис. 2в).

Виробництво адіпокіну в адипоцитах людини, що лікуються римонабантом, і SVC. Зрілі адипоцити та SVC, виділені від людей з ожирінням ОАТ, культивували із 100 нМ римонабантом (Rim) або без нього протягом 24 годин. Рівні мРНК адипокіну ( a, c ) були кількісно визначені за допомогою RTQ-PCR, нормалізовані до рівнів TBP і представлені як відносна експресія порівняно з контрольними клітинами. Концентрація ApN у середовищі ( b ) вимірювали RIA і виражали як нг мл -1. Результати є середніми значеннями ± sem для 12-15 (мРНК) або 18 (секреція білка) людей з ожирінням. * P

Регулювання ApN за допомогою модуляції CB1R ( a ) не залежить від рівнів цАМФ ( b, c ). ( a ) CB1R модуляція експресії гена ApN в адипоцитах. Адипоцити культивували з використанням 100 нМ римонабанту (Rim) або 1 мкМ ACEA протягом 24 годин. Рівні мРНК ApN представлені як відносна експресія порівняно з контрольними адипоцитами. ( b ) Інгібування продукції цАМФ для стимульованої римонабантом експресії гена ApN в адипоцитах. Адипоцити культивували з або без MDL-12330A (20 мкМ) протягом 25 годин, тоді як Rim (100 нМ) додавали протягом останніх 24 годин. Рівні мРНК ApN представлені як відносна експресія порівняно з контрольними адипоцитами. ( c ) Збільшення виробництва цАМФ в Римі та профілактика MDL. Для вимірювання цАМФ адипоцити культивували в безсироватковому середовищі (2% BSA) із 100 нМ ободом або без нього протягом 10 хвилин. За 1 годину до обробки краю додали 20 мкМ MDL-12330A. Рівні CAMP вимірювали методом ІФА та нормалізували вміст білка в адипоцитах. Результати є середніми значеннями ± sem для семи ( a ), вісім ( b ) та п’ять ( c ) з ожирінням. * Р 28

Таким чином, ми дослідили, чи стимулювання гена ApN римонабантом спричинене підвищенням рівня цАМФ. Посилення регуляції мРНК ApN римонабантом не змінювалось з використанням інгібітора аденилатциклази MDL-12330A (рис. 3b). Тим не менше, цей інгібітор був ефективним, оскільки він запобігав збільшенню рівня цАМФ, спричиненого римонабантом в адипоцитах (рис. 3b). У сукупності ці дані свідчать про те, що цАМФ може не брати участь у регулюванні ЄС ApN. Далі ми блокували компоненти сигналізації MAP-кінази за допомогою специфічних інгібіторів p38MAPK (SB203580), ERK1/2 (PD98059) та JNK (SP60025). Ці інгібітори тестували під час стимуляції сигналізації CB1R. Цю стратегію було обрано, оскільки базальне фосфорилювання компонентів MAPK було відносно низьким, і тому здавалося легшим виявити збільшення (а не зменшення) рівня фосфорилювання. Жоден з інгібіторів, що використовуються окремо, не змінив експресію гена ApN (не показано). Зниження експресії ApN за допомогою АСЕА було повністю скасовано селективним інгібітором p38MAPK (P

Коротше кажучи, ES безпосередньо регулює імунний баланс OAT при ожирінні людини. Зокрема, блокада CB1R полегшує стан запалення як в адипоцитах, так і у SVC, або за рахунок збільшення вироблення ApN та оментину, або за рахунок зменшення MIP-1β та IL-7. ЄС регулювання ApN частково включає p38MAPK.