предметів

реферат

Точність пошуку аксональних шляхів та формування функціональних нервових ланцюгів мають вирішальне значення для того, щоб організм обробляв, зберігав та отримував інформацію з внутрішніх мереж, а також навколишнього середовища. Вважається, що варіації в міграції аксонів призводять до утворення петлі та самофасцикуляції, що може призвести до вкрай дисфункціональної нервової системи, і тому вважається, що регуляторним механізмом контролю синаптогенезу є самообмеження аксонів. Тут ми представляємо застосування нещодавно розробленого безконтактного оптичного методу із застосуванням слабофокусованого ближнього інфрачервоного лазерного променя для високоефективного аксонального наведення та демонструємо утворення аксональних петель в кортикальних нейронах, показуючи, що кортикальні нейрони самі можуть фасулювати на відміну від самоуникнення. Здатність світла утворювати аксональну нано-петлю відкриває нові шляхи для побудови складних нейронних ланцюгів та неінвазивної провідності нейронів на великі робочі відстані для відновлення пошкоджених нейронних зв’язків та функцій.

На додаток до топографічних 17 та хімічних 18 стимулів було використано широкий спектр інших інноваційних методів, включаючи електричний 19, оптичний 20, 21, 22, 23 та гібридні підходи, такі як електрохімічний 24, потоки опторідин 25 та фотохімічні 26 подразників. . для цілей аксонального наведення. Хоча існуючі оптичні методи базуються на принципах привабливої ​​провідності, ми виявили, що ближні інфрачервоні (БІК) лазерні промені можуть діяти як репелентні сигнали 27, 28. У цьому випадку ми використовували слабкофокусований NIR-лазерний промінь, щоб вести коркові аксони щурів високоефективним способом, що дозволило нам сформувати петлі з різним радіусом і вперше спостерігати аксональну фасцикуляцію. Завдяки прискореному впровадженню та інтеграції цієї технології з іншими інструментами для оптичних маніпуляцій та зображень, ми представляємо ефективний інструмент для побудови та вивчення основних будівельних блоків нейронних ланцюгів in vitro з високою точністю і, нарешті, для розуміння та управління складними нейронними ланцюгами in vivo у просторових та часових сферах. Зрештою, цей метод може також створити нові можливості для лікування розладів нервової системи, пов’язаних із невідповідністю аксонів.

Результати і обговорення

Хоча було показано, що світло діє як приваблива мітка при прямому ударі по конусу росту (із конкретними планами опромінення), ми використовували ефект відстані, використовуючи погано сфокусоване джерело світла NIR, яке ми вважаємо в даний час фототермічним. 28, 29. Для формування петлі випадковим чином відбирали аксони зі швидкістю росту> 20 мкм/год. Крім того, лазерна пляма не застосовується лише на поперечній відстані (2 - 8 мкм) від конуса зростання (ГХ), але низька об'єктивна NA (0,5 NA, об'єктив 20 × мікроскоп) знаходиться на осьовій відстані

аксона

а) Оптична лінія з екологічною камерою. (b) Ліва панель: зображення типового аксона до і після повороту. Положення лазерної точки позначається червоним кружком. Права панель: затримка в часі перекриття валу аксона після взаємодії з лазерним променем. Напрямок початкового конуса зростання позначений стрілкою. Псевдокольорові лінії, проведені по валу аксона в різні моменти часу і перекриваються. Інтервал часу між кольорами становить 2 хвилини на кольоровій панелі.

Повнорозмірне зображення

а) Фазово-контрастні зображення двох нейронів кори головного мозку щурів (а) до та (б) після оптичного наведення. Прямокутник, що показує цікаву область для оптичного наведення. Шкала: 50 мкм. (c - k) Зображення з інтервалами часу оптично виготовленої аксональної петлі, що показує положення лазерних точок (червоні кола). (l - n) Самофасцикуляція аксона. Шкала: 10 мкм.

Повнорозмірне зображення

Формування петлі (рис. 2к) демонструє безпрецедентну здатність цього відштовхувального оптичного методу кию досягти повного кругового наведення без будь-яких топографічних меж, що повинно дозволити створювати складні нейронні схеми in situ. Цікаво, що радіус кривизни петлі, утвореної цим методом, можна спостерігати як

5 мкм (дорівнює найменшому радіусу, виявленому у випадкових петлях, що спонтанно утворюються in vitro, Додаток. Рис. 1). Після формування оптично керованої петлі (рис. 2к), хоча ми припускали, що ГК буде просуватися по вихідному аксональному стволу, оптично керований корковий аксон щура продовжував рости поруч, при цьому самозвонення спостерігалося на великих відстанях і в часі (Рис. 2 л). - п). Це наводить нас на думку, що гіпотеза самообмеження може бути не універсальною для всіх типів аксонів, і що певні нейрони можуть використовувати її на свою користь для утворення пучків із собою, тим самим зменшуючи синаптогенез 16. Додаток. Плівки 3 і 4 демонструють збільшену площу та все поле зору утворення ущільнювальної петлі та процес самофаскуляції за допомогою просторово-часової модуляції індукованої лазером відштовхувальної кий. Псевдокольорові накладення контуру аксонального валу, взяті з процесу формування петлі, наведені в Suppl. Фіг.

а) Кінетика кута повороту коркового аксона, керованого лазером за допомогою лінзи з 20-кратним мікроскопом. (b) Накопичувальні графіки для розподілу аксональних кутів повороту, керованих лазером. в) Кінетика чистого зростання аксонів під час оптичного наведення. (d) Швидкість росту під час багатоступеневого обертання модульованого часом лазерного променя. (e) Зображення осьової провідності з інтервалом часу (3 хвилини) з використанням просторово сформованого профілю балки (позначеного червоною лінією) Шкала: 10 мкм.

Повнорозмірне зображення

Далі ми дослідили, чи можна аксонові петлі утворити з меншими радіусами кривизни за допомогою імпульсної світлової мітки і чи модулюється самофасциляція коркового аксона таким різким поворотом. На фіг. На фіг.4А показані тимчасові знімки (a - j) лазерного виробництва аксональної петлі з радіусом кривизни 5 мкм), яка була стабільною, стабільність менших петель зменшувалась із зменшенням радіуса петлі (рис. 4C).

(А) Побудова I-петлі методом лазерного аксонального наведення. (a - j) Фазово-контрастні зображення оптично виготовленої I-петлі з інтервалом часу (3 хвилини) повного збирання коркового аксона назад до його валу. Шкала: 10 мкм. (B) Виробництво електронних петель за допомогою лазера. (а - г) Фазово-контрастні зображення оптичного втілення петлі в кортикальному нейроні щура (4 хвилини). (e - h) Самоочищення оптично керованого аксона та зменшення радіуса кривизни оптично виконаної петлі. Шкала: 10 мкм. Позиції лазерних точок позначені червоними колами. (C) Кінетика зміни діаметра петлі для аксональних петель різного радіуса. (D) Діаграма графіку проти еквівалентної сили для аксонів з різною кількістю мікротрубочок (10-100 з кроком 10). Вертикальні лінії (червона: I-петля, чорна: E-петля, синя: O-петля) вказують на три досягнуті кінцеві радіуси кривизни аксональних петель.

Повнорозмірне зображення

(А) Проміжок часу фазово-контрастних зображень, що демонструють запобігання утворенню перспективних петель відштовхувальним оптичним сигналом у коркових аксонах щурів (лазерна крапка, позначена червоним кружком). Лазерна пляма була переміщена через 8 хвилин і вимкнена через 23 хвилини. Помічено, що Аксон зачарований собою протягом періоду спостереження через 26 хвилин. (B) Відносна динаміка кута обертається під час запобігання петлі за рахунок початкового (коротка червона стрілка) та вторинного (довга червона стрілка) оптичного наведення. (C) Відносна динаміка довжини під час запобігання петлі через початкові (коротка червона стрілка) та вторинні (довга червона стрілка) оптичні лінії. Кінець оптичної лінії позначений чорною стрілкою.

Повнорозмірне зображення

З недавніми досягненнями нових оптичних засобів стимуляції та візуалізації 40 можна було б проводити неінвазивне загальнооптичне тестування обчислювальної природи оптично сформованої нейронної схеми. Крім того, за допомогою інфрачервоного лазера для сенсибілізації нейронів шляхом трансфекції генів, що кодують опсин 46, а також двох фотонних оптогенетичних стимуляцій 40 та оптичних зображень 40, 41 можна досягти швидкого прогресу в повністю оптичному контролі формування та активності нейронних ланцюгів. Хоча було виявлено, що ця відразлива настанова є всюдисущою для різних типів нейронів (клітини гангліозних рибок, клітини кортикального нейрона щурів та гангліозні клітини спинного кореня), з інтеграцією біо- та конформних нанофотонних технологій 47, нові можливості для генетично сенсибілізуючих специфічних нейронів які реагують на певні довжини хвилі лазера і таким чином вибірково проводять їх in vivo .

висновки

методи

Експериментальні процедури, описані в цьому рукописі, були проведені згідно з Техаським університетом у протоколі Інституційного комітету з догляду та використання тварин Арлінгтона.

Культура нейронів кори

Усі експериментальні процедури проводились згідно з протоколом Інституційного комітету з догляду та використання тварин. Коркові нейрони виділяли із ембріональних ембріонів щурів протягом 18 днів. Коркові тканини відокремлювали, очищали (мозковий шар), ферментативно дисоціювали (0,15% трипсину в середовищі L-15) протягом 20 хвилин при 37 ° C. Дисоційовані коркові нейрони (100000/пристрій) інокулювали на полі-D-лізин (PDL, 0,01%, Sigma), попередньо покрите покривне скло з полідиметилсилоксановим бар’єром (Sylgard 184, Dow corning) та безсироваткове культуральне середовище (нейробазальне середовище). доповнений B-27 з BDNF та NT-3, 10 нг/мл) змінювали кожні 3 дні.

Налаштування аксональної навігації

Схема платформи для аксональної навігації показана на фіг. 1а. Настроюваний ближній інфрачервоний промінь Ti: Sapphire (MaiTai HP, Newport-SpectraPhysics), який працює в режимі вимкнення, був розширений і переданий за допомогою складаних дзеркал до заднього лазерного порту інвертованого мікроскопа (Ti-U Eclipse, Nikon). ). Механічний затвор (Uniblitz) використовувався для імпульсу лазерного променя (20 мс увімкнено і 20 мс вимкнено) для запобігання постійному підвищенню температури або механічного примусу. Для направлення променя у задню апертуру об'єктива використовували дихроїчне дзеркало за допомогою 20-кратного мікроскопа (Ph1, NA = 0,5, Nikon), передаючи видиме світло для відображення фазового контрасту. ІЧ-фільтр відсікання використовувався на шляху зображення для видалення відбитого лазерного променя для отримання ПЗС (фотометрія). Довжина хвилі та потужність лазерного променя регулювались програмним забезпеченням для досягнення потужності променя зразка -80 мВт. Потужність лазера в площині зразка розраховували шляхом множення цільового коефіцієнта пропускання на потужність, виміряну на задній апертурі об'єктива мікроскопа, використовуючи стандартний вимірювач потужності світла (PM 100D, Thorlabs). Для досягнення оптичного наведення промінь був розміщений поза філоподіями аксонів, асиметрично розміщений на шляху зростаючих аксонів.

Вимірювання орієнтації конуса зростання

Початкова орієнтація аксонів вказується як еталон, а наступні гілки вимірювали щодо цього початкового положення. Прикладаючи силу до конуса зростання, конус росту також запобігає появі лазерної плями. Для цього було встановлено, що ГХ не тільки відвертається від лазерної точки, але і повертається назад. Цю динаміку обертання визначали кількісно, ​​реєструючи зміну проекції конуса зростання на плоску поверхню за допомогою програмного забезпечення Image J. Кожного разу, коли GC піднімається з поверхні, ми бачимо лише прогнозовані довжини в напрямках X та Y. ми можемо легко досягти кута обертання.

Теоретичний розрахунок еквівалентної сили, необхідної для визначення радіуса вигину в аксональному напрямку

Мікротрубочки - це довгі волокна, які служать шляхами для міжклітинних рухових білків і полегшують структурні функції в клітинах еукаріотів. В типовому аксоні вважається, що в будь-якому даному перерізі аксонального валу від 10 до 100 таких мікротрубочок. Процеси полімеризації конуса зростання аксонів асиметрично модулюються фототермічним градієнтом, генерованим ближньо-інфрачервоним лазерним променем, в результаті чого передається хімічна "еквівалентна сила". Для аналізу деформації або вигину аксона внаслідок сили на його кінчику (конус росту) ми змоделювали аксон як пучок правильного і рівномірного перерізу, виготовлений з лінійного еластичного матеріалу (мікротрубочки з відомою жорсткістю 48 вигинів ). ), який є однорідним та ізотропним із навантаженням, зосередженим на аксональному терміналі. Методології, що використовуються для кількісної оцінки цих відхилень, в принципі можна класифікувати на аналітичні або аналітичні методи. Аналітичний метод базується на теорії Ейлера-Бернуллі (ЕБ), яка забезпечує засіб кількісної оцінки таких відхилень. Потім метод кінцевих елементів використовується для отримання розчину радіуса вигину кривизни аксонального валу при постійній силі на наконечник. Деталі описані в додаткових методах.