дозрівання

  • реферат
  • Головний
  • методи
  • Відбір проб.
  • Імуноблот-аналіз MCD, ACC та AMPK.
  • Відбір зразків.
  • Аналіз даних.
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • Демографія пацієнта.
  • Вікові зміни у вираженні MCD.
  • Вікові залежності змін експресії АСС та фосфорилювання.
  • Вікові зміни у віковій експресії та фосфорилюванні AMPK.
  • Вплив гіпертрофії міокарда на експресію MCD та експресію ACC та AMPK та фосфорилювання.
  • ОБГОВОРЕННЯ
  • Обмеження навчання.
  • глосарій

реферат

Після пологів різке зниження рівня CoA в малонілі призводить до швидкого дозрівання окислення жирних кислот. Раніше ми показали, що зменшення малонілового КоА зумовлене підвищеною активністю малоніл КоА декарбоксилази (МКД) та зниженою активністю ацетил КоА карбоксилази (АСС), ферментів, які розкладають та синтезують малоніл КоА. Зниження активності АСС відповідає збільшенню активності 5'-АМФ-активованої протеїнкінази (АМФК), яка фосфорилює та інгібує АСС. Ці зміни затримуються гіпертрофією міокарда. Оскільки швидкість окислення жирних кислот може впливати на здатність серця протистояти ішемічним пошкодженням, ми дослідили експресію MCD, ACC та AMPK у серці новонародженої людини. Біопсія шлуночків була отримана у дітей, які перенесли серцеву хірургію. Імуноблот-аналіз показав позитивну кореляцію між експресією MCD та віком. Навпаки, спостерігалась негативна кореляція між експресією АСС та АМФК та ​​віком. Усі зразки шлуночків демонстрували певний ступінь гіпертрофії, але відмінностей у експресії ферментів між помірною та важкою гіпертрофією не виявлено. Це свідчить про те, що підвищена експресія MCD та знижена експресія ACC та AMPK є важливими регуляторами дозрівання окислення жирних кислот у серці новонародженої людини.

Головний

Регулювання обміну жирних кислот у серці. АСС інактивується фосфорилюванням за допомогою P-AMPK. Активний АСС каталізує карбоксилювання ацетил-КоА до малоніл-КоА, який інгібує фермент, що обмежує швидкість жирних кислот мітохондрій, СРТ-1. MCD каталізує декарбоксилювання малоніл CoA до ацетил CoA, тим самим знімаючи інгібування CPT-1, (a) активної форми, (i) неактивної форми, (+) стимулює, (-) інгібує.

Повнорозмірне зображення

На окислення жирних кислот у серці можуть впливати різні патофізіологічні стани, такі як гіпертрофія міокарда. У дорослих гіпертрофія міокарда пов’язана з різкими змінами в енергетичному обміні, особливо з переходом до фетотипу феталіпу плоду (20–22). У новонароджених гіпертрофія міокарда затримує дозрівання окислення жирних кислот через постійно підвищений рівень малонілу CoA, підвищену активність АСС та зниження активності AMPK (17). Ця затримка у дозріванні окислення жирних кислот може призвести до того, що серце новонародженого покладається на гліколіз як основне джерело АТФ, а метаболічний зсув спостерігається також у гіпертрофованому серці дорослого (20-22).

Гіпертрофія міокарда може спостерігатися у педіатричних пацієнтів з вродженими вадами серця, такими як тетралогія фалота (TOF), гіпопластичний синдром лівого серця (HLHS), дефекти атріовентрикулярної перегородки (AVSD), дефекти шлуночкової перегородки (VSD) або обструкція тракту відтоку правого шлуночка. (RVOTO). Невідомо, чи змінює гіпертрофія міокарда експресію ферментів, що регулюють рівень Малонілу КоА, а отже, і дозрівання окислення жирних кислот у серці новонародженої людини.

методи

Відбір проб.

За згодою законного представника у немовлят, які перенесли кардіохірургічну операцію, було вилучено 26 зразків правого шлуночка міокарда розміром від 18 до 200 мг для виправлення вроджених вад серця. Зразки отримували із зразків, які зазвичай резецируються та викидаються в рамках хірургічної процедури. Були проведені операції та взяті зразки в лікарні Університету Альберти, Центр наук про здоров’я Уолтера К. Маккензі в Едмонтоні, Альберта, Канада. Етичне схвалення було надано Етичною радою з досліджень етичного здоров’я в Університеті Альберти, файл № 4876. Усі тканини негайно заморожували в рідині N2 і зберігали при -80 ° C до використання для біохімічного аналізу.

Імуноблот-аналіз MCD, ACC та AMPK.

Для біохімічного аналізу гомогенізували 25 ± 2 мг тканини в буфері, що містив 0,05 М трис-HCl, 0,25 М манітолу, 1 мМ ЕДТА, 1 мМ ЕГТА, 50 мМ фтористого натрію, 5 мМ пірофосфату натрію, 1 мМ дитиотрейтолу. 0,1% (об./об.) інгібітор протеази тканин ссавців (Sigma Chemical Co. Aldrich, Oakville, ON), 1% (об./об.) інгібітор фосфатази I коктейль (Sigma Chemical Co.-Aldrich, Oakville, ON), коктейль інгібітор фосфатази II ( Sigma Chemical Co.-Aldrich, Oakville, ON) та 10% (мас./Об.) Гліцерину. Гомогенати очищали центрифугуванням і супернатант збирали для біохімічного аналізу. Кількість білків визначали за допомогою методу Бредфорда. Західні імуноблоти виконувались, як описано раніше (16). MCD імуноблотували антитілом проти MCD (антитіло H2-40, приготовлене власноруч). АСС іммуноблотували антитілом кролика проти фосфо-АСС (Ser79) (Upstate Cell Signaling Technologies США, Шарлоттсвілль, штат Вірджинія) або кон’югованим з пероксидазою антитілом до стрептавівдіну (KPL, Gaithersburg, MA). AMPK імуноблотували антитілом antiPhospho-AMPK (Thr 172) (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA) або антиAMPK антитілом (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA).

Відбір зразків.

Оскільки гіпертрофія міокарда може зменшити окислення жирних кислот пропорційно до ступеня її вираженості (26), зразки стратифікували на основі ступеня тяжкості гіпертрофії. Гіпертрофія класифікована серцевими дитячими хірургами як легка, середня та важка, враховуючи тип ураження та вік пацієнта. Там, де це було можливо, кількісне визначення товщини стінки правого шлуночка проводили за допомогою М-режиму/двовимірної ехокардіографії, як у вигляді довгої, так і короткої осі, з переднім краєм до переднього краю на тому ж рівні, що і м’язи сосочка лівого шлуночка на кінець діастоли. У випадках, коли ехокардіографічні записи були недоступні, гіпертрофію класифікували виключно за типом ураження та віком пацієнта.

Аналіз даних.

Завдяки великому обсягу зразків було проведено 3 гелі для кожного ферменту, що контролюється (MCD, P-ACC, ACC, P-AMPK та AMPK). Існує ймовірність незначних змін титрів первинних та вторинних антитіл, що використовуються при західній імуноблоттінгу. Як результат, логарифм для всіх вихідних значень був врахований для будь-якого зміщення даних (рис. 2-4). Нормалізацію середнього значення ± SD для кожної групи проводили для усунення невеликих відмінностей між окремими гелями, дозволяючи пряме порівняння. Таким чином, зразки від немовлят у віці від 0,2 до 10 місяців були отримані в 26 зразків. Вікові залежності змін експресії ферментів визначали методом лінійної регресії. За необхідності результати виражаються як середнє значення ± SEM. Відмінності в експресії MCD, ACC та AMPK між клінічно легкою та важкою гіпертрофією оцінювали за допомогою U-тесту Манна-Уітні. Результати вважали значущими в с

Нормалізована експресія MCD у тканині міокарда правого шлуночка у немовлят у віці від 0,2 до 10 місяців (n = 26), що свідчить про вікове збільшення експресії MCD (r = 0,42, p = 0,03). Вставка містить репрезентативні західні імуноблоти.

Повнорозмірне зображення

РЕЗУЛЬТАТИ

Демографія пацієнта.

Всього було отримано 26 біопсій правого шлуночка (10 зразків у пацієнтів та 16 зразків у чоловіків) у новонароджених у віці від 5 днів (0, 2 місяці) до 10 місяців, які пройшли хірургічну корекцію VSD, HLHS, AVSD, TOF. або RVOTO (таблиця 1). Ці зразки використовувались для оцінки вікових змін експресії MCD, а також вікових змін експресії АСС та AMPK та фосфорилювання. Усі пацієнти мали певний ступінь гіпертрофії міокарда. Як правило, було виявлено, що у пацієнтів з RVOTO є сильна гіпертрофія (табл. 1). Для характеристики ефектів гіпертрофії міокарда на експресію MCD, ACC та AMPK було обрано підмножину пацієнтів (n = 5 на групу) подібного віку (середній вік = 3,5 місяця) з помірною або важкою гіпертрофією (див. Розділ 4.8). нижче).

Стіл в натуральну величину

Вікові зміни у вираженні MCD.

Спочатку оцінювали вплив віку на експресію серцевого МЦД, ферменту, відповідального за декарбоксилювання малонілового КоА до ацетил КоА. Спостерігалось значне (р = 0,03) вікове збільшення експресії МЦД (рис. 2), що свідчить про те, що з дорослішанням дитини збільшення експресії МКД, швидше за все, зменшує вміст малоанілу КоА і, таким чином, дезінгібує СРТ-1, що призводить до дозвільний вплив на окислення довголанцюгових жирних кислот міокарда. Однак через обмежену доступність зразків у цьому дослідженні не вимірювали рівні малонілового КоА у біопсіях шлуночків.

Вікові залежності змін експресії АСС та фосфорилювання.

Крім того, оцінювали вплив віку на серцеву експресію АСС. Хоча серце експресує ізоформи АСС 265 кД та 280 кД, переважає ізоформа 280 кД, і ми не змогли виявити ізоформу 265 кД за допомогою західного імуноблотингу. Було значне (р = 0,002) вікове залежне зниження експресії АСС (рис. 3), що свідчить про те, що в міру дорослішання серця зниження експресії АСС, швидше за все, зменшує синтез малонілового КоА. Оскільки АСС може фосфорилювати в серіні-79 та інгібуватися АМРК, ми також вимірювали рівні Р-АСС за допомогою фосфоспецифічних антитіл. Вікових змін ступеня фосфорилювання АСС не було. Це свідчить про те, що синтез малонілового КоА та дозрівання окислення жирних кислот, швидше за все, регулюються рівнем експресії АСС, а не станом фосфорилювання АСС у серці новонародженої людини.

Нормалізована експресія АСС у тканині міокарда правого шлуночка у немовлят у віці від 0,2 до 10 місяців (n = 26), що свідчить про вікове залежне зниження експресії АСС (r =, 0,66, p = 0,002). Вставка містить репрезентативні західні імуноблоти.

Повнорозмірне зображення

Вікові зміни у віковій експресії та фосфорилюванні AMPK.

Для подальшого дослідження цього були додатково оцінені ефекти віку на експресію AMPK. Відмічено значне (р = 0,04) вікове залежне зниження експресії AMPK (рис. 4). Не було вікової залежності зміни ступеня фосфорилювання (активації) AMPK, як визначали нормалізацією P-AMPK до загальної кількості AMPK, виявленої в кожному зразку біопсії шлуночка.

Нормалізована експресія AMPK у тканині міокарда правого шлуночка у немовлят віком 0-10 місяців (n = 26), що свідчить про вікозалежне зниження експресії AMPK (r =, 0,41, p = 0,04). Вставка містить репрезентативні західні імуноблоти.

Повнорозмірне зображення

Вплив гіпертрофії міокарда на експресію MCD та експресію ACC та AMPK та фосфорилювання.

Усі зразки біопсії шлуночків у цьому дослідженні показали різну ступінь гіпертрофії серця (табл. 1). Обмежена кількість зразків біопсії шлуночків, класифікованих як клінічно легкі (n = 1) та поміркована гіпертрофія (n = 2), виключає будь-який статистичний аналіз можливих змін у експресії MCD, ACC та AMPK. Вплив гіпертрофії на експресію MCD, ACC та AMPK обмежувався зразками біопсії шлуночків, класифікованими як клінічно легка або важка гіпертрофія. Експресію MCD, ACC та AMPK оцінювали у двох групах (n = 5 на групу) у віковому діапазоні 2-6 місяців з клінічно легкою або важкою гіпертрофією (таблиця 2). Ніякої різниці в експресії MCD, ACC або AMPK не спостерігалося між легкою та важкою гіпертрофією. Однак у пацієнтів з важкою гіпертрофією порівняно з пацієнтами з помірною гіпертрофією (табл. 3) спостерігалося значне (p = 0,03) зменшення відношення β-AMPK (активного) до загального AMPK.

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

ОБГОВОРЕННЯ

У цьому дослідженні вивчались наслідки віку та гіпертрофії міокарда на експресію серцево-судинної MCD, а також на експресію АСС та AMPK в серці та фосфорилювання. Зразки біопсії шлуночків, отримані від педіатричних пацієнтів у віці від 0,2 до 10 місяців, збільшували вікову залежність експресії МЦД. На відміну від цього, залежно від віку, АКК та АМФК виражалися без будь-якого вікового впливу на фосфорилювання будь-якого з ферментів у серці новонародженої людини. Гіпертрофія (важка гіпертрофія проти помірної гіпертрофії) не впливала на експресію МЦД, експресію АСС та фосфорилювання. Хоча між вираженою та помірною гіпертрофією не було значної різниці в експресії AMPK, фосфорилювання AMPK було знижено на початку сильної гіпертрофії. Ці дані свідчать про те, що зміни експресії MCD, ACC та AMPK, швидше за все, підтримують зміни вмісту CoA малонілу (не оцінювались у цьому дослідженні), особливо щодо дозрівання окислення жирних кислот у серці новонародженої людини під час старіння. Ці дані також дозволяють припустити, що зміни фосфорилювання AMPK (тобто активації), але не експресії AMPK, можуть бути причиною відмінностей у швидкості дозрівання окислення жирних кислот, що спостерігається при різних ступенях гіпертрофії міокарда в серці новонародженої людини.

Дослідження експресії MCD виявило вікове збільшення після народження. Ця підвищена експресія, ймовірно, регулює дозрівання окислення жирних кислот, оскільки збільшення вмісту MCD може збільшити деградацію малонілу CoA і, таким чином, дезінгібувати CPT 1, обмежуючий швидкість фермент мітохондріальних жирних кислот. Це підтверджується попередніми висновками в серці новонароджених кроликів, де спостерігається різке зниження вмісту малонілового КоА з 1 до 7-денного віку, що узгоджується з 10-кратним збільшенням окислення жирних кислот. Активність MCD сама по собі не змінюється через різницю в доставці жирних кислот до серця новонародженого (27). Хоча ми не могли визначити активність MCD у біопсіях шлуночків через обмежений характер зразків, попередні дослідження показали, що активність MCD збільшується із збільшенням віку серця новонародженого (11). Хоча це дослідження не оцінювало експресію MCD (11), воно підтверджує потенційну важливість змін експресії MCD, які лежать в основі змін активності MCD і, таким чином, регулюють вміст малонілу CoA та дозрівання окислення жирних кислот у новонародженому серці.

Експресія MCD, ACC та AMPK у вибраній групі пацієнтів подібного віку не виявила жодних відмінностей між легкою та важкою гіпертрофією. Гіпертрофію класифікували за віком та типом ураження після біопсії серця, коли на товщину стінки правого шлуночка не впливали параметри гемодинаміки та тиску серця in vivo. Хоча в попередньому звіті було описано затримку дозрівання окислення жирних кислот у серцях свиней з гіпертрофією новонароджених (до 21-денного віку), що частково зумовлено підтримкою активності АСС та зниженою експресією каталітичної α-субодиниці AMPK (17), відсутність доступних зразків біопсії шлуночків без будь-якого ступеня гіпертрофії не дозволило оцінити таку гіпертрофію у цьому дослідженні. Цікаво, що експресія та ступінь фосфорилювання AMPK не відрізнялися між помірною та важкою гіпертрофією як такою, але спостерігалося значне зменшення β-AMPK, оскільки вона нормалізувалась до спостережуваної загальної кількості AMPK. Це може свідчити про те, що ступінь гіпертрофії може впливати на фосфорилювання і, отже, на активацію AMPK. Однак цей ефект гіпертрофії слід інтерпретувати з обережністю, оскільки ця різниця, хоча і статистично значуща, може не бути фізіологічно значущою, оскільки вона є результатом значних змін загального та фосфорильованого АМФК між легкою та важкою гіпертрофією (Таблиця 3).

Обмеження навчання.

На закінчення, це дослідження продемонструвало вікове збільшення експресії MCD, а також вікове зменшення експресії ACC та AMPK у зразках біопсії правого шлуночка, отриманих у немовлят, які перенесли операцію з метою корекції різних вроджених вад серця. Оскільки не відбулося вікових змін у фосфорилюванні АСС та АМФК, це свідчить про те, що рівні експресії, а не активність, можуть бути важливими регуляторами дозрівання окислення жирних кислот у серці новонародженої людини при наявності різного ступеня гіпертрофії.,