Резюме

Гостра черепно-мозкова травма - це серйозна травма, яка на сьогоднішній день не була належним чином піддана лікуванню. Багатофотонна мікроскопія дозволяє поздовжньо вивчити процес розвитку гострої травми головного мозку та дослідити терапевтичні стратегії у гризунів. У цьому протоколі продемонстровано дві моделі гострої черепно-мозкової травми, вивчені за допомогою двофотонних зображень мозку in vivo.

Анотація

Вступ

Гостра черепно-мозкова травма є проблемою охорони здоров’я з високим рівнем травматизму в автомобільних аваріях, падіннях чи нападах, а також високою поширеністю хронічної інвалідності, що настає в подальшому. Терапевтичні підходи до лікування черепно-мозкової травми залишаються повністю симптоматичними, обмежуючи ефективність долікарняної, хірургічної та критичної допомоги. Це робить соціально-економічний вплив мозкової травми особливо важким. З різних причин більшість клінічних випробувань не показали поліпшення відновлення після травми головного мозку з використанням нових терапевтичних підходів.

Моделі на тваринах мають вирішальне значення для розробки нових терапевтичних стратегій на етапі, коли можна прогнозувати ефективність наркотиків у хворих з травмами мозку. В даний час існує кілька добре усталених моделей травми голови на тваринах, включаючи контрольований кортикальний удар 1, перкуторну травму рідини 2, динамічну деформацію кори 3, падіння ваги 4 та фототравму 5. Для експериментальних моделей було використано ряд експериментальних моделей. вивчити деякі морфологічні, молекулярні та поведінкові аспекти патології, пов’язаної з травмою голови. Однак жодна модель на тваринах не має повного успіху у підтвердженні нових терапевтичних стратегій. Розробляючи надійні, відтворювані та контрольовані тваринні моделі черепно-мозкової травми, необхідно оцінювати складні патологічні процеси.

Тут ми пропонуємо метод стереотаксичної пункції голкою шприца, який можна поєднувати з одночасним місцевим застосуванням препарату, як вдосконалену модель місцевих травм головного мозку та як інструмент для вивчення патофізіологічних наслідків гострої травми в мозку ссавців. у природніх умовах.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Всі представлені тут процедури проводились відповідно до місцевого керівництва з догляду за тваринами (Закон Фінляндії про експерименти над тваринами 62/2006). Ліцензія на тварин (ESAVI/2857/04.10.03/2012) була отримана від місцевих органів влади (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Дорослих мишей віком 1-3 місяці, вагою 24-38 г, утримували в індивідуальних клітках в сертифікованих тваринницьких закладах університету і завжди з їжею та водою за бажанням.

1. Візуалізація травми мозку через черепне вікно

2. Візуалізація травми мозку через розведений череп

Діаметром від 0,5 до 1,5 мм. Використовуйте стиснене повітря під час буріння для видалення кісткового сміття. Виконуйте проколювання періодично під час процедури розрідження, щоб уникнути перегрівання, спричиненого тертям. Охолодити свердло, використовуючи розчин, до кімнатної температури і періодично наносити буфер на розріджену ділянку для поглинання тепла.
ПРИМІТКА. Щоб уникнути пошкодження кори, не свердліть великі ділянки (> 1,5 мм) тонким шаром (необхідна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Ми оптимізували дві операційні процедури: 1) хронічне черепне вікно та 2) витончення черепа шляхом посттравматичної візуалізації мозку у трансгенних мишей. Схематичний вигляд експериментальних препаратів представлений в Фігура 1. Травматичну пункцію сталевою голкою 0,3 мм OD (30 г) наносять на пробурену свердловину (Малюнок 1А). Успішна підготовка вікна черепа дозволяє проводити візуалізацію на глибині до 650 м нижче поверхні піала (Малюнок 1B), в той час як витончення черепа, як правило, обмежує приблизно 300 мкм (Малюнок 1С), як було продемонстровано у 3D-реконструкції кортикальних пірамідних нейронів миші Thy1-YFP-H.

Пункційна травма призводить до видалення дендриту та руйнування капілярних мереж в контрольованому обсязі кори головного мозку. Протягом перших двох днів площа ураження збільшується, а травма спричиняє появу дендриту та утворення дендритної ретракції цибулини в зонах перилезії, як це спостерігається за допомогою багатофотонної мікроскопії в реальному часі. (Малюнок 2).

Витончення черепа проводили при активації зображення та міграції мікроглії у мишей CX3CR1-EGFP відразу після травми. (Малюнок 3A). Зображення SHG пропонує цінний інструмент для точного розмежування місця пошкодження (Малюнок 3B). Позаклітинні матричні молекули, які виробляють сигнали груп самодопомоги, значно збагачуються в паренхімі мозку при травмі голкою. Спочатку відновлюються дрібні мікрогліальні процеси, потім мікрогліальні клітини мігрують до краю місця пошкодження (Малюнок 3A).

Щоб оцінити можливі ураження, спричинені введенням тонкої скляної піпетки та доставкою барвника, ми провели експерименти з двофотонною мікроскопією in vivo з мікроін’єкцією сульфородаміну 101 у мишей Thy1-YFP-H без травми мозку. Репрезентативні зображення показані у Малюнок 4 продемонструвати ін’єкцію мілассіту через 3 години після ін’єкції. Слід введення піпетки можна побачити в мозкових оболонках, візуалізованих ШГГ (Малюнок 4A). Астроцити маркуються сульфородаміном 101, введеним ін’єкційно (Малюнок 4B). Дендрити, які експресують YFP під промотором Thy1, не демонструють морфологічних ознак пошкодження, таких як цибулини, що просочуються або втягуються (Малюнок 4 В).

супроводжується

Рисунок 1. Метод гострої травми головного мозку в поєднанні з тонкими препаратами черепного вікна або черепа в поєднанні з двофотонною мікроскопією in vivo. ДО. Травматичний прокол сталевою голкою 0,3 мм OD (30G), застосованою для буріння свердловини. Голка ненадовго занурюється в мозок глибиною 0,5-2 мм від дна лунки. B, C . 3D-реконструкція кортикальних пірамідних нейронів миші Thy1-YFP-H у жовтому кольорі та схематичний вигляд експериментальних препаратів. Сигнал другої гармоніки витонченого черепа (SHG) відображається сірим кольором (С). D. Яскраве поле зору поверхневих судин через скляне вікно відразу після гострої черепно-мозкової травми. І. Розведений череп перед нанесенням травми. Обрана область інтересу (біла рамка) та точка накладання проколу (червоне коло). Слід зобразити іншу область (червоне поле) витонченої області, щоб відстежувати можливі артефакти, викликані хірургічним втручанням.


Рисунок 2. Приклад поздовжньої багатофотонної візуалізації розвитку травми мозку через витончений череп. A. Паравіста р місця пошкодження, оточеного міченими YFP дендритами кортикальних нейронів через 20 хв після нанесення травми, що відображається через витончений препарат черепа. B. Збільшений вигляд області, що відображається на панелі А. С. Та сама ділянка мозку, що і в B, відновлена ​​через 5 днів після травми. Дендритне подрібнення показано білими стрілками, дендритні ретракційні лампи - червоними стрілками.


Рисунок 3. Приклади моніторингу запалення та активації глії під час розвитку черепно-мозкової травми з використанням різних маркерів, придатних для візуалізації in vivo білків у мультифотоні, наприклад, флуоресцентний сигнал, барвник та сигнал другої гармоніки. Зображення були отримані через 3 години після травми головного мозку. А. Активація мікроглії, що експресує GFP (зелена) та міграція після гострої черепно-мозкової травми, відображеної через черепне вікно у мишей CX3CR1-EGFP; покоління другої гармоніки (SHG) показано сірим кольором. B. Експресують GFP (зелений) та сульфородамін 101 (червоні) астроцити у мишей GFAP-EGFP навколо місця ураження, що описується потужним сигналом генерації другої гармоніки (сірим) від молекул позаклітинного матриксу. Стрілки вказують на приклади клітин мікроглії (ДО) і астроцити (B) після травми. Межа місця пошкодження ідентифікується зі знаком групи самодопомоги та відображається пунктиром.


Малюнок 4. Випробування тканин на удар, проведене шляхом ін'єкції розчину через скляну мікропіпетку. ДО. Сліди (показані штриховою лінією) у ГСГ, що візуалізує мозкові оболонки через 3 години після ін’єкції. B. Мічені сульфородаміном астроцити, введені ін'єкцією. C. Дендрити, що експресують YFP під промотором Thy1. D. Комбіноване зображення ДО (SHG - сірий), B (астроцити - червоні), C. (дендрити нейронів - жовтий).

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Травма мозку - це різка непередбачувана подія. Тут ми описуємо модель тварини, яка відтворює спектр патологічних змін, що спостерігаються у пацієнтів людини після травми мозку, таких як нейродегенерація, видалення дендриту, набряк мозку, гліальні рубці, крововиливи в кору головного мозку, а також вогнищеве субарахноїдальне крововилив та підвищена проникність гематоенцефалічний бар’єр. Для вивчення первинного та вторинного патогенезу, а також відновлення після травми цю модель пошкодження поєднували з поздовжньою візуалізацією in vivo нейрональних та гліальних структур. Використовували лінії трансгенних мишей, які експресують флуоресцентні білки в нейронах (Thy1-YFP-H) 7, астроцитах (GFAP-EGFP) 8 або мікрогліях (CX3CR1-EGFP) 9. Крім того, використовувалося друге покоління гармонік (SHG) візуалізація та завантаження астроцитів сульфародаміном 101 10.

Описана тут модель повторює проникаючий тип пошкодження мозку. Отже, обмеження цієї моделі полягає в тому, що вона не надає інформації про механізми закритої травми голови. Нещодавно Еспада та співавтори повідомили, що результати багатофотонної візуалізації впливають на поведінку клітин у периконтузіальній корі 6. Враховуючи, що закрита черепно-мозкова травма є більш частим медичним випадком, методологічний підхід, про який повідомляють автори, є дуже перспективним доповненням до традиційних методів дослідження в поле удару травми головного мозку 11.

Ми використовували як хронічне черепне вікно 12, так і препарати для витончення черепа 13 для вивчення поведінки клітин у посттравматичних умовах у живому мозку. Обидва методи мають певні переваги та обмеження. Таким чином, хронічне черепне вікно забезпечує кращу роздільну здатність, оптичне проникнення глибше в тканини мозку та комфорт для кількох сеансів візуалізації. І навпаки, витончення черепа рідше спричиняє запалення в місці візуалізації, і, що ще важливіше, дозволяє багаторазово застосовувати ліки та барвники. Деякі приклади фармакологічних засобів, що застосовуються в цьому типі експерименту, наведені в Таблиця 1.

Таблиця 1. Фармакологічні засоби та барвники для кортикальних ін’єкцій у моделі пункційного ураження.

Широкий спектр біохімічних подій, що мають велике значення у фізіологічних та патологічних станах, можна дослідити за допомогою хімічних інгібіторів, флуоресцентних репортерів та мутантного білка, що вводяться через вірусні конструкції. Переваги для вибору певного часового вікна, що надаються препаратом для витончення черепа, можуть мати велике значення для досліджень.

У цьому дослідженні ми використали сигнал генерації другої гармоніки для окреслення області ураження. Альтернативно, межі місця ураження можуть бути позначені слабко дифузійним флуоресцентним барвником, наприклад, флуоресцентним кон'югатом декстрану з високою молекулярною масою (2 млн. Далтон).

Нещодавно Шаффер та його колеги 14 застосовували хронічний препарат із відчиненим черепним вікном для повторної доставки флуоресцентних барвників до кори миші. Ймовірно, що відкриття черепного вікна може негативно вплинути на прозорість мозкової тканини. З іншого боку, важко передбачити часовий перебіг запалення, викликаного повторним відкриттям, яке може вплинути на регенерацію сполучної тканини.

Великою перевагою витонченого препарату черепа є можливість доставляти терапевтичні сполуки (та інші матеріали, які потребують місцевого введення в тканини мозку) кілька разів під час прогресування травми, не ускладнюючи артефакти (наприклад, не відчиняючи черепне вікно).

У тих випадках, коли не потрібен прямий доступ до зони пошкодження, настійно рекомендується накрити витончену ділянку черепа скляним покривним склом, як описано в роботі про підготовку полірованого та зміцненого тонкого черепа Клейнфельда та його колег 15. Це можна зробити за допомогою наступної додаткової процедури. Покладіть невелику краплю агарози (1,5%) на витончену область черепа, почекайте, поки вона перетвориться на гель, видаліть всю непотрібну агарозу, тобто залиште її лише на місці пошкодження. Агароза повинна захищати місце пошкодження від зовнішніх впливів. Висушіть область черепа, розбавлену стисненим повітрям. Нанесіть невелику кількість акрилового клею на невеликий шматочок покривного ковпачка № 0 і покладіть його на витончену область черепа. Поліакриловий клей запобігає відростанню кісток і сполучної тканини, завдяки чому череп витончений під збереженим вікном.

Поєднання цих процедур дозволяє вивчати гострі та хронічні посттравматичні процеси, вводити препарати місцевим або системним шляхом та безпосередньо контролювати ефекти лікування. Використання подвійних або потрійних трансгенних ліній миші також може бути корисним, особливо для одночасного зображення кількох посттравматичних процесів, таких як формування гліального рубця та відростання нейронів гілок. Ми сподіваємось, що наші моделі гострої черепно-мозкової травми, вивчені за допомогою прижиттєвої двофотонної мікроскопії, були плідними для тестування на наркотики.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.