Резюме
Тут ми представляємо протокол індукції постінсультної депресії у щурів шляхом закупорки середньої мозкової артерії через внутрішню сонну артерію. Ми використовуємо тест на примусове плавання Porsolt та тест на перевагу сахарози для підтвердження та оцінки викликаних депресивних станів настрою.
Анотація
Вступ
Інсульт є четвертим у списку смертельних захворювань у Сполучених Штатах 1, 2, 3, тоді як він спричиняє більшість інвалідностей серед дорослих у розвинених країнах. 4; Це робить інсульт провідним суперником серед найбільших проблем зі здоров'ям у світі. Нормальність у людей, які пережили інсульт, рідкісна: близько 15% -40% постраждалих потерпілих страждають на постійну втрату працездатності, 20% потребують інституційної допомоги через 3 місяці після початку інсульту 5, і приблизно одна третина 6-місячних вижилих, яким потрібні інші, щоб допомогти їм пережити кожен день 6. Очевидно, інсульт також являє собою збільшення національних витрат на охорону здоров'я 7. За оцінками Американської асоціації серця, витрати, пов’язані з інсультом, у Сполучених Штатах перевищують 50 мільярдів доларів у 2010 році 8 .
Інсульт не тільки завдає людям довгострокової шкоди, але деякі люди, які вижили, як правило, страждають від емоційних та поведінкових розладів, таких як деменція, втома, тривога, депресія, марення та агресія 9, 10, 11, 12, 13, 14. Найбільш повторюваним психологічним наслідком після інсульту є постінсультна депресія (ПСД), діагностована приблизно у 40% -50% тих, хто вижив 15, 16, 17. Депресія, спричинена інсультом, спричинює збільшення захворюваності та смертності 18, 19, 20, 21, 22. Патофізіологія ПСД до кінця не вивчена, але, схоже, вона спричинена багатьма факторами і пов’язана з інвалідністю, когнітивними порушеннями та місцем пошкодження 23 .
Модель щурячої вогнищевої ішемії мозку, створена Mcao, є найбільш розповсюдженою тваринною моделлю інсульту 24, 25, 26, 27. Демонструючи індукцію PSD у щурів шляхом оклюзії СМЖ через ICA, використовуються методи, що мінімізують смертність та мінливість у моделі MCAO 28 .
Основна мета цього протоколу - окреслити етапи індукування PSD у щурів шляхом блокування MCA за допомогою ICA, модифікованої моделі MCAO, яка зменшує смертність і призводить до мінливості 28. Конкретні цілі включають проведення неврологічних та гістологічних досліджень (визначення показника неврологічної тяжкості [NSS], обсягу зони інфаркту та набряку мозку) для перевірки ефективності MCAO та використання поведінкових тестів для вивчення впливу цієї процедури MCAO у розвиток емоційних розладів, переважно PSD.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Комітет з догляду за тваринами Університету Бен-Гуріона з Негева, Ізраїль, затвердив усі процедури лікування та тестування, що використовуються в цьому протоколі.
1. підготовка щурів до експериментальної процедури
Примітка: Виділіть дорослих самців щурів Sprague-Dawley вагою 300-350 г.
- Утримуйте щурів, по чотири в клітці, у віварії при 22 ° C і вологості 40%, зі зворотним 12-годинним циклом світло/темрява (вимикається о 8:00 ранку) та необмеженим доступом до їжі та води.
- Випадковим чином розподіляють щурів на дві групи, а саме на групу MCAO (n = 24) та групу Sham (n = 19).
2. підготовка щурів до операції
3. хірургічне втручання (техніка MCAO)
Примітка: Виконайте операцію, як описано Бойком та співавт. 28 та використовувати інструменти, надані McGarry et al. 29 та uluç та ін. 30 .
- Зробіть вентральний розріз по середній лінії та розсічіть поверхневу фасцію.
- Акуратно виконайте різку та сильну дисекцію в межах трьох м’язів у формі трикутника (грудиноподібний, дігастральний та грудинно-соскоподібний м’язи) для виявлення сонних артерій (ЧМТ, ВСА та загальної сонної артерії).
- Ретельно розкрийте та викрийте правильні CCA та ICA.
- Відокремте правий CCA та ICA від блукаючого нерва.
Примітка: Визначивши сонні артерії, як це передбачено на кроці 3.2, ICA буде визнано половиною відділень CCA разом з TBI. - Вставте мононитковий зонд (нейлоновий притуплений або силіконовий 4-0 нейлоновий) безпосередньо через ICA,
4. післяопераційне відновлення
- Введіть 5 мл 0,9% сольового розчину кожному щуру внутрішньочеревно, відразу після операції, щоб запобігти зневодненню.
- Вводити знеболення безумовно в перший день після операції; застосовуйте мелоксикам 1 мг/кг SQ q24 год. давати розведений дипірон (0,5 г, розчинений у 400 мл питної води) щурам, що мають симптоми болю протягом перших 3 днів.
- Жертвуйте будь-якого судомного щура (судоми викликані підвищеним внутрішньочерепним тиском через набряк мозку або церебральний крововилив 28).
5. оцінка неврологічної тяжкості 31
Примітка: Цю процедуру виконують два спостерігачі, які не беруть участі в хірургічній процедурі; вони проводять тест на неврологічний дефіцит та моторний дефіцит за сукупним балом 0-4 32. Оцінка цього балу може проводитися з різними інтервалами часу; у цьому дослідженні його проводили через 50 хв, 24 год, 7, 15 та 30 днів після операції. Ось кроки для оцінки сенни. Хоча це не є необхідністю у цій ситуації, цей показник необхідний для визначення інсульту у гризунів для призначення лікування.
- Покладіть щура на керамічну підлогу і дайте їй вільно рухатися протягом 1 хв.
- Акуратно потягніть щура за хвіст і оцініть наступним чином.
- Оцінюйте щура з оцінкою 0 за відсутність неврологічних дефіцитів.
- Оцініть щура з оцінкою 1 за згинання передньої кінцівки.
- Оцініть щура з оцінкою 2 за контралатеральний слабкий хват передньої кінцівки.
- Оцініть щура з оцінкою 3 за обхід паретичної сторони, коли його кидають за хвіст.
- Оцініть щура з оцінкою 4 за спонтанне коло 32 .
Примітка: Якщо спостерігається більше однієї з реакцій, перевага віддається дії з вищим балом.
6. визначення обсягу інфаркту (гістологічне дослідження)
7. вимірювання набряку мозку 38
Примітка: Набряк головного мозку вимірювали через 24 години після останнього MCAO. Евтаназувати тварин з важким неврологічним дефіцитом, що заважає годуванню та/або питтю протягом принаймні трьох днів, втратою ваги понад 20%, геміплегією або судомами.
- Оцініть величину набряку правої півкулі, використовуючи суму коронально вирізаних ділянок для обчислення обсягів правої та лівої півкуль у довільних одиницях (пікселях).
Примітка: Для цього розрахунку використовуйте програмне забезпечення ImageJ 1.37 v після оптичного сканування (роздільна здатність: 1600 x 1600 dpi). Виберіть цікаву область та скористайтеся функцією за розміром в меню аналіз . У нашому дослідженні використовувались макроси. - Виразіть область набряку мозку як відсоток від стандартних ділянок у неушкодженій контралатеральній півкулі.
- Обчисліть ступінь набухання, використовуючи рівняння, розроблене вище 39 .
8. поведінкові парадигми
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Гістологічні дані (Таблиця 1) виявив статистично значущий об’єм інфаркту у відсотках від загальної кількості мозку (p фігура 2А) і мали більшу тривалість нерухомості (p фігура 2B) Порівняно із імітованими щурами.
Рисунок 1: графічна демонстрація хронології протоколу. Різні тести, які проводяться на щурах у різний час, показані на схемі: MCAO = оклюзія середньої мозкової артерії на початку експерименту; NSS = оцінка неврологічної тяжкості, 50 хв, 24 год та 7 та 30 днів після MCAO; та поведінкові тести (переваги сахарози та тести примусового плавання за Порсольтом) на 30-33 дні після MCAO. Ця цифра була модифікована за посиланням Ifergane et al. Чотири. П’ять. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Рисунок 2: Тест на перевагу сахарози, проведений з 30 по 33 день із застосуванням MCAO (n = 16) та підставних контрольних щурів (n = 14). Відсоток переваги сахарози (%). Щури MCAO споживали менше сахарози (стор. 45. Будь ласка, натисніть тут, щоб переглянути більшу версію цього малюнка.
Малюнок 3: Тест на примусове плавання Порсольта, проведений з 30 по 33 день після MCAO (n = 16) та після Sham процедури (n = 14). Тривалість нерухомості (у секундах). Час нерухомості в тесті вимушеного плавання був значно більшим у групі MCAO, ніж у групі фіктивних (с. 45. Будь ласка, натисніть тут, щоб переглянути більшу версію цього малюнка.
Гістологічні знахідки | Група оклюзії середньої мозкової артерії | Групою керував Шам |
Загальний мозок (обсяг інфаркту) | 8,8% ± 6,5 | 0,3% ± 0,1 |
Набряк мозку | 10,2% ± 4,6 | 2,6% ± 1,2 |
Усі дані представляють середнє значення групи ± S. E. M |
Таблиця 1: Гістологічні дані щодо обсягу інфаркту та набряку мозку. MCAO = оклюзія середньої мозкової артерії (n = 5); Фіктивний (n = 5).
Оцінка неврологічної тяжкості | Група оклюзії середньої мозкової артерії | Групою керував Шам |
50 хв після операції | 2,75 ± 0,14 | 0,0 ± 0,0 |
Через 24 год після операції | 3,2 ± 0,15 | 0,0 ± 0,0 |
Через 7 днів після операції | 0,91 ± 0,2 | 0,0 ± 0,0 |
Усі дані представляють середнє значення групи ± S. E. M |
Таблиця 2: Оцінка неврологічної тяжкості (NSS) для MCAO та штучних щурів. MCAO = оклюзія середньої мозкової артерії (n = 16); Фіктивний (n = 14). Ця таблиця взята з Ifergane et al. Чотири. П’ять .
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Один із способів того, як представлена тут методика MCAO може вважатися безпечнішою за оригінальну модель MCAO, ілюструється тим фактом, що ЧМТ та її гілки, включаючи потиличну артерію, язиковий термінал та верхньощелепну артерію, не є компрометованими шляхом оклюзії MCA через ICA. Відставання оригінальної моделі TCE MCAO (та його гілок) при дистальному розтині та коагуляції в 46 викликає порушення жування через компроміс із судинною подачею жувальних м’язів 47. Деструкція м’яза може з часом призвести до вивільнення додаткової обчислювальної динаміки рідини. На відміну від оригінальної методики MCAO, при якій доступ до MCA відбувається через ЧМТ, описана тут методика модифікована для інсульту, без переривання кровотоку в ТВК та її притоках.
Найважливіші аргументи переваги нової моделі MCAO перед оригінальною MCAO полягають у її здатності значно зменшити варіабельність набряку мозку, обсягу інфаркту та зміни ваги, а також зменшити смертність, пов'язану з MCAO. Смертність при процедурах MCAO є важливим фактором 48; рівень смертності 20% вважається розумним 49, 50. Рівень смертності (20% для початкового MCAO, 12,5% для нового MCAO та 0% для контролю) у поточному дослідженні знаходився в межах допустимого рівня, але нова техніка MCAO була кращою, ніж Оригінальний MCAO.
Щури, які піддавались новій процедурі MCAO, втрачали менше ваги відразу після операції і набирали більше ваги в кінці дослідження, ніж щури, яким застосовували оригінальну методику MCAO 28. Більша втрата ваги та менший приріст ваги у щурів, які перенесли оригінальний MCAO, можуть спричинити АПФ ліганду під час операції, спричиняючи дистальну гіпоперфузію на лицьовій, мовній та верхньощелепних артеріях, а також пошкодження м’язів, що підтримують жування, пов’язане з ішемією. Якщо жування погіршується, пероральне споживання зменшується, що в поєднанні з катаболізмом може спричинити втрату ваги, а в довгостроковій перспективі - поганий неврологічний результат, захворюваність та смерть 43. Доступ до MCA через ACI не вимагає втручання в TCE та його відділення. Отже, під час нової процедури MCAO ніяких перешкод не виникає, і щури, які проходять процедуру, не мають проблем із вагою, захворюваністю чи смертністю.
Тести, що використовуються для оцінки основних депресивних факторів, таких як депресивна поведінка, ангедонія, нерухомість та порушення навчання та пам'яті, є стандартизованими процедурами, що застосовуються на тваринних моделях депресії 51, 52. На поведінковий тест, такий як тест на примусове плавання Порсольта, зазвичай впливають незвичні рухові навички після MCAO. Тут цей тест застосовували з 30 по 33 день після хірургічної процедури, щоб визначити, що індукція PSD у модифікованих щурів MCAO не впливала надмірно на їх моторику. Згідно з результатами, щури в експериментальній групі демонстрували загальну поведінку втечі, порівнянну з поведінкою щурів-підставних. Щури MCAO мали значно більше невдалих втеч, значно більшу тривалість нерухомості та зменшену перевагу сахарози порівняно з підставними тваринами. Це свідчить про те, що цей метод MCAO є здатною альтернативою оригінальному методу MCAO.
Різниця між включенням та виключенням щурів у процедуру MCAO для більш широкої експериментальної оцінки значною мірою залежить від результату операції. За допомогою індукційної моделі PSD, пов’язаної з MCAO, деякі небажані побічні ефекти MCAO можуть бути зменшені, залишаючи простір для включення менших і, можливо, крихких щурів у процедуру MCAO. Представлена тут модель тварини MCAO пропонує сценарій зменшення ненавмисних результатів після індукованої MCAO PSD, оскільки вона може зменшити варіабельність змін ваги, набряку мозку та обсягу інфаркту, а також пов'язаних із цим випадків смерті. Ця методика може служити інструментом для оцінки майбутньої терапії PSD та надання доклінічних даних про ефективність терапевтичних речовин, а також для моніторингу інших факторів, що змінюють умови клінічного результату інсульту та PSD.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
- 9 звичок, які вбивають нейрони та впливають на здоров’я мозку - Краще зі здоров’ям
- Гостра травма мозку у мишей, що супроводжується поздовжнім двофотонним протоколом візуалізації (переклад на
- Як аневризма мозку впливає на людей похилого віку
- Фізична активність і мало калорій сповільнюють старіння мозку
- 5 продуктів, які можуть зменшити ризик інсульту Business Insider Іспанія