стеатозу

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Створення моделі миші з біалельною делецією GRP78 та PTEN у печінці
  • Зниження GRP78 у печінці з нульовим значенням PTEN сприяло стеатозу печінки, пошкодженню печінки та проліферації жовчних шляхів.
  • Запечена cPf/f78f/f показали посилену проліферацію, проліферацію клітин-попередників та реекспресію GRP78 у клітинах жовчних проток.
  • Порушення селективних сигнальних шляхів у печінці cPf/f78f/f
  • Прискорений розвиток HCC та CC та повторне заселення GRP78-позитивних клітин у печінці cPf/f78f/f
  • обговорення
  • Додаткова інформація
  • Файли зображень
  • Додаткове зображення S1
  • Додаткове зображення S2
  • Додаткове зображення S3
  • Додаткове зображення S4
  • Додаткове зображення S5
  • Додаткове зображення S6
  • Додаткове зображення S7
  • Документи Word
  • Додаткова інформація

предметів

  • Стільникова сигналізація
  • Смажений рак
  • Захворювання печінки
  • Білки-супресори пухлини

реферат

Глюкоза, регульована білком 78 (GRP78), також відома як BiP/HSPA5, належить до сімейства HSP70. GRP78 є основним шапероновим білком ендоплазматичної сітки (ER), критичним для контролю якості білка в ER, а також головним регулятором реакції на розвинений білок. 1, 2 Під навантаженням ER GRP78 титрується шляхом накопичення неправильно складених білків, вивільнення та активація розроблених сенсорів реакції білка для відновлення гомеостазу ER. У відповідь на тривалий і важкий стрес ER, деградована реакція білка викликає апоптотичні шляхи, що ведуть до загибелі клітин. 3 Масові дані свідчать про те, що субфракція GRP78 локалізується на клітинній поверхні в патологічних умовах, таких як ракові клітини. 2, 4 Клітинна поверхня GRP78 діє як багатофункціональний рецептор для регулювання сигнальних шляхів, таких як активація сигналізації PI3K/AKT для виживання та проліферації раку. 5, 6

Гепатоцелюлярна карцинома (HCC) та холангіокарцинома (CC) є найпоширенішими первинними видами раку печінки та пов'язані з поганим прогнозом. В даний час відсутність ефективних методів лікування запущеного раку печінки підкреслює необхідність розуміння туморогенних механізмів печінки. Супресор пухлини, PTEN (гомолог з фосфатазою і тензоном, видаленим у хромосомі 10), який кодує непотрібну ліпідну фосфатазу з плазматичної мембрани, яка антагонізує сигнальний шлях PI3K, 7 мутує або видаляється у 40-50% печінки людини ракові захворювання. 8 Втрата PTEN активує шлях PI3K/AKT, що призводить до прогресування раку у багатьох ракових пухлин людини. Елімінація специфічного для печінки PTEN у мишей спричиняє пошкодження печінки та печінки, що активізує клітини-попередники і з часом стають клітинами, що ініціюють пухлину

12 місяців) призводить до розвитку як HCC, так і CC. 9, 10 Клітини-попередники печінки біпотенціальні і спокійно розташовані в ніші стовбурових клітин. Під час хронічного або масивного ураження печінки клітини-попередники печінки активуються для проліферації та диференціювання в гепатоцити та холангіоцити (клітини жовчних проток). Однак дерегульовані попередники печінки можуть призвести до раку печінки. 11

результат

Створення моделі миші з біалельною делецією GRP78 та PTEN у печінці

Схема розведення для створення наступних п’яти груп мишей-когорт показана на додатковому малюнку S1. Вони включають наступне: (1) один гомозиготний нокаут Pten з Alb-Cre (cP f/f); (2) гомозиготний нокаут Птена та гетерозиготний нокаут Grp78 з Alb-Cre (cP f/f 78 f/+); (3) гомозиготний нокаут Pten і Grp78 з Alb-Cre (cP f/f 78 f/f); (4) простий гомозиготний нокаут Grp78 з Alb-Cre (c78 f/f); та (5) WT, отриманий із посліду тварин без трансгену Alb-Cre, який служить нормальним контролем. Інший штам миші Alb-Cre з попереднього дослідження був використаний у цьому селекційному наборі. Це дозволило нам перевірити, чи залишковий GRP78, який спостерігався в печінці c78 f/f, був обумовлений мінливістю активності Cre між різними трансгенними штамами мишей.

Зниження GRP78 у печінці з нульовим значенням PTEN сприяє стеатозу печінки, пошкодженню печінки та проліферації жовчних шляхів.

Відповідно до попередніх звітів, гістологічний аналіз печінки 9, 20 через три місяці показав незначне накопичення ліпідів у мишей cP f/f та c78 f/f (рис. 2а). На відміну від цього, краплі жиру були помітні в печінці cP f/f 78 f/+ та cP f/f 78 f/f (рис. 2а). Масляно-червоне фарбування O ще більше підтвердило більш важкий стеатоз печінки cP f/f 78 f/f (рисунок 2b). Крім того, через 2 місяці у двох із п’яти печінок cP f/f 78 f/f було виявлено проліферацію жовчовивідних шляхів (рис. 2а). Відповідно до посиленого накопичення ліпідів, рівні мРНК ліпогенних генів SREBP-1c, ACC1 та FAS були підвищеними в печінці cP f/f 78 f/f порівняно з мишами WT та cP f/f (рис. 2c). Останні дані свідчать про те, що фактор транскрипції XBP-1 є регулятором печінкового ліпогенезу. 23 У цьому дослідженні ми спостерігали незначне зрощення мРНК Xbp-1 у печінці c78 f/f, що узгоджується з попередніми даними. Однак сплайсинг Xbp-1 був мінімальним у печінці cPf/f 78 f/f (додатковий малюнок S4a). ATF4 також бере участь у експресії ліпогенних генів; Однак 24 ми не виявили підвищеного рівня білка ATF4 у печінці cP f/f 78 f/f (додатковий малюнок S4b).

Печінка cP f/f 78 f/f показала посилену проліферацію, проліферацію клітин-попередників та реекспресію GRP78 у клітинах жовчних проток.

Пошкодження печінки, як правило, індукує регенерацію через проліферацію. 11 Для визначення проліферації печінки ми дослідили експресію Ki67 у печінці мишей. Ми спостерігали значне збільшення Ki67-позитивних клітин у печінці cP f/f 78 f/fv порівняно з мишами cP f/fa c78 f/fv у віці 3 та 6 місяців, тоді як Ki67-позитивні клітини відсутні у WT печінка (рисунок 3а). Крім того, деякі Ki67-позитивні клітини з морфологією клітинних клітин-попередників були виявлені навколо жовчних проток у печінці cP f/f 78 f/f (рис. 3а). Маркери печінкових попередників EpCAM, CK19 та AFP також регулювались у печінці cP f/f 78 f/f порівняно з печінкою WT, cP f/f та c78 f/f, додатково вказуючи на проліферацію (рис.

Печінка cP f/f 78 f/f показала посилену проліферацію, розширення клітин-попередників та експресію GRP78 у клітинах жовчних проток. a ) Імуногістохімічне фарбування маркера клітинної проліферації Ki67 (коричневі ядра) на печінці зазначених генотипів через 3 і 6 місяців. b ) Кількісний ПЛР-аналіз у реальному часі маркерів-попередників EpCAM, AFP та CK19 у печінці зазначених генотипів через 3 місяці. Рівні експресії кожного гена нормалізувались до рівнів 18S РНК. Дані представлені як середнє значення ± se * P f/f 78 f/f. Чорні стрілки в a a c вкажіть приклади жовчних проток. Шкала показує 100 мкм і застосовується до всіх панелей.

Повнорозмірне зображення

Як продемонстрував Вестерн-блот-аналіз, залишковий GRP78 був виявлений у печінці cP f/f 78 f/f. Щоб отримати огляд моделі розподілу GRP78 у мишей cP f/f 78 f/f, ми провели імуногістохімічне фарбування зрізів печінки. Відповідно до наших результатів вестерн-блот (рисунок 1b та ​​додатковий малюнок S2a), експресія GRP78 поступово знижувалася у віці від 3 до 6 місяців. Дивно, але розширені клітини жовчних проток у печінці cP f/f 78 f/f показали сильне фарбування GRP78 як через 3, так і через 6 місяців (рис. 3в). Це свідчить про те, що деякі гепатобласти з неповною опосередкованою Cre-рекомбінацією диференціюються в жовчні протоки, де Alb-Cre був неактивним. Крім того, деякі GRP78-позитивні клітини навколо жовчних проток морфологічно нагадували попередників печінки (рис. 3в).

Порушення селективних сигнальних шляхів у печінці cP f/f 78 f/f

Порушення селективних сигнальних шляхів у печінці cP f/f 78 f/f . a ) Репрезентативні вестерн-плями p-AKT (S473), загального AKT, p-ERK1/2 (T202/Y204) та загального рівня ERK1/2 з печінки зазначених генотипів через 6 місяців. ( b ) Репрезентативні вестерн-плями рівня p-JNK (p54, T183/Y185) та загального JNK (p54). ( c ) Репрезентативні вестерн-плями експресії β-катеніну та PDGFRα. Β-актин використовували як контроль завантаження, а відповідні кількісні показники показані праворуч. n = 3 для кожного генотипу. Дані представлені як середнє значення ± se * P f/f 78 f/f

Повнорозмірне зображення

обговорення

По-перше, чому зменшення GRP78 у поєднанні з делецією PTEN у печінці прискорює пухлиновий генез, тоді як нокаут GRP78 в інших тканинах зазвичай інгібує утворення пухлини? Рак печінки унікальний тим, що рак викликаний травмами та регенерацією. Щодо втрати PTEN, ми спостерігали, що зменшення GRP78 сприяло розвитку печінкового стеатозу, мабуть, за допомогою незалежного від XBP-1 механізму, що призвів до пошкодження, яке спричинило проліферацію клітин-попередників. Якщо у пухлинних клітинах усунути експресію GRP78, розвиток пухлини можна зупинити, як це спостерігається в інших моделях раку. Однак у випадку cP f/f 78 f/f печінки клітини жовчних проток та GRP78-позитивні клітини-попередники, які втекли з Alb-Cre, повторно повторювали печінку; отже, на розвинені пухлини печінки дефіцит GRP78 не впливав. Відповідно до цього пояснення є висновок, що β-катенін-позитивні клітини знову заселяють β-катенін-нульові печінки через поступову втрату експресії Alb-Cre. 32 і GRP78-позитивні клітини швидко повторно заселяють кишковий епітелій при генетичному нокаутуванні в AhCre1-Grp78. f/f миша. 33

Щодо походження HCC та CC у печінці cP f/f 78 f/f, HCC та CC могли бути отримані з клітин-попередників печінки. Наші дані імуногістохімії свідчать про сильну експресію GRP78 у тканинах HCC та CC, а також про те, що деякі клітини поблизу проліферуючих жовчних проток демонстрували морфологію клітин-попередників клітин печінки, а також експресували GRP78. Ці спостереження припускають можливість того, що клітина-попередник печінки має злоякісне походження. Цікаво, що було продемонстровано трансдиференціацію гепатоцитів у епітеліальні клітини жовчних проток. 34 І навпаки, деякі епітеліальні клітини жовчі, здається, здатні диференціюватися в гепатоцити. 35 Тому будуть потрібні подальші дослідження, щоб визначити, чи викликають GRP78-позитивні клітини жовчних проток GRP78-позитивний рак печінки.

Повідомлялося про надмірну експресію GRP78 при різних пухлинах, включаючи HCC. 36, 37 GRP78 як головний шаперон з потужними антиапоптотичними властивостями та регулятором сигналу захищає пухлинні клітини від стресу ER та захист клітин господаря, тим самим сприяючи росту пухлини. Це узгоджується з нашими спостереженнями про те, що GRP78 був підвищеним при регуляції при cP f/f пухлинах печінки (додаткова фігура S6). Повідомляється, що GRP78 захищає клітини раку печінки від ER-індукованого апоптозу та сприяє їх інвазії в метастатичній моделі. 37, 38 Справжня експресія GRP78 дійсно може знадобитися для прогресування раку печінки. Оскільки розробляється кілька терапевтичних засобів проти GRP7813, буде цікавим лікування раку печінки за допомогою цих засобів, щоб перевірити, чи можуть вони заблокувати реекспресію GRP78 та придушити прогресування раку печінки, зберігаючи при цьому необхідну функцію печінки. При лікуванні інших видів раку засобами, що містять GRP78, оскільки печінка дорослої людини може нормально функціонувати з частковим рівнем GRP78, тоді як рак вимагає високого рівня GRP78, пошкодження нормальної печінки може бути обмеженим. Як нещодавно повідомлялося, антитіла проти клітинної поверхні GRP78 добре переносились у фармакокінетичних/токсикологічних дослідженнях на мишах, мавпах та пацієнтах. 39, 40

Сигнальний шлях JNK пов'язаний з індукованим канцерогеном ростом HCC, і приблизно 50-60% людського HCC демонструє сильну активацію JNK1. 41 Функція стійкої активації JNK при загибелі гепатоцитів та подальшому запаленні та канцерогенезі узагальнена на різних генетичних моделях мишей, що розвивають HCC. 30 Наші результати показали, що p-JNK дещо підвищувався в печінці cP f/f 78 f/f через 6 місяців, супроводжуючись посиленням запалення (дані не наведені) перед утворенням HCC та CC, припускаючи, що JNK може частково сприяти прискоренню роботи печінки . туморогенез. Оскільки для цього необхідне підтвердження, ступінь апоптозу залишався низьким (нижче 2%) у cP f/f 78 f/f печінки через 6 місяців (дані не наведені); таким чином, легка активація JNK у цих печінках не суттєво впливала на апоптоз, пов'язаний з безперервною активацією JNK.