реферат

Мозок сильно збагачений n-3 поліненасиченими жирними кислотами (PUFA), докозагексаєновою кислотою (22: 6n-3, DHA) та n-6 PUFA арахідоновою кислотою (20: 4n-6, AA). 1 у ссавців, DHA та AA отримують із раціону або синтезують шляхом знежирення/розширення їх відповідних харчових попередників, α-ліноленової кислоти (18: 3n-3) та лінолевої кислоти (18: 2n-6). 2 DHA і АА етерифікуються в sn-2 положенні мембранних фосфоліпідів, де вони відіграють роль у регулюванні плинності мембран, а після вивільнення фосфоліпазою А2 відіграють важливу роль у передачі сигналів мозку, 3 нейрозапалення 4 та їх відповідних метаболітах. 5 та біполярний розлад. Збалансований склад мембран n-3 і n-6 PUFA у фосфоліпідах має вирішальне значення для нормальної роботи мозку. 8, 9

методи

Кількісна оцінка DHA

Загальні ліпіди витягували з лобової кори методом Фолча. Відоме кількість 1,2-дигептадеканоїл-sn-гліцеро-3-фосфохоліну (Sigma Chemical Co., Сент-Луїс, Міссурі, США) додавали до частини тканини як внутрішній стандарт перед екстракцією. Метилові ефіри жирних кислот утворювались нагріванням частини загальних екстрактів ліпідів у 1% H 2 SO 4 в метанолі при 70 ° С протягом 3 годин. Метилові ефіри екстрагували та розділяли на капілярній колонці розміром 30 х 0,25 мм (SP-2330, Supelco; Bellefonte, PA, USA) з використанням газової хроматографії з полум'яним іонізаційним детектором (модель 6890N, Agilent Technologies; Palo Alto, CA, CA). США). Експерименти розпочинали при 80 ° C, з градієнтом температури до 160 ° C (10 ° C/хв) та 230 ° C (3 ° C/хв) протягом 31 хвилини та підтримували при 230 ° C протягом 10 хвилин. Піки визначали за часом утримання стандартів метилового ефіру жирних кислот (Nu-Chek-Prep, Elysian, MN, USA). Концентрації DHA у фронтальній корі (мкмоль/г вологої маси в мозку) розраховували пропорційним порівнянням площі піку газової хроматографії з площею внутрішнього стандарту гептадеканової кислоти (17: 0). 34

Препарат цитозолю

Цитоплазматичні та ядерні екстракти готували з лобової кори, як описано вище. Коротко кажучи, кору гомогенізували в 10 мМ HEPES, рН 7,9, 0,1 мМ EDTA, 0,1 мМ M EGTA, 1 мМ DTT, 10 мМ KCl, коктейлі, що інгібують протеазу (Roche, Indianapolis, IN, USA). ) за допомогою тефлонового гомогенізатора скла. Після додавання 0,5% NP-40 було проведено ще п’ять ударів гомогенізації. Суспензію інкубували протягом 10 хвилин на льоду, а потім центрифугували в мікроцентрифузі при 13000 g протягом 1 хвилини при 4 ° C. Супернатант містив переважно цитоплазматичні компоненти. Концентрації білка в цитоплазматичних та ядерних екстрактах визначали за допомогою білкового реагенту Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Вестерн-блот-аналіз

Білки з цитоплазматичних та ядерних екстрактів (75 мкг) розділяли на 10-20% SDS-поліакриламідних гелях (PAGE) (Bio-Rad). Після SDS-PAGE білки електрофоретично переносили в нітроцелюлозну мембрану. Блоки цитоплазматичних білків інкубували протягом ночі в буфері TBS, що містить 5% несушеного сухого молока та 0,1% Tween-20, зі специфічними первинними антитілами (розведення 1: 200) для групи IVA cPLA2, групи IIA sPLA2 та групи VIA iPLA 2 36 ( Санта-Крус Біотех, Санта-Крус, Каліфорнія, США). Блоки цитоплазматичного білка інкубували з відповідними кон'югованими HRP вторинними антитілами (Bio-Rad) та візуалізували за допомогою реакції хемілюмінесценції (Amersham, Piscataway, NJ, США) на рентгенівській плівці (XAR-5, Kodak). Оптичну щільність смуг імуноблотів вимірювали за допомогою програмного забезпечення Alpha Innotech (Alpha Innotech, Сан-Леандро, Каліфорнія, США) та нормалізували до β-актину (Sigma) для корекції нерівномірного навантаження. Всі експерименти проводили двічі, і значення виражали у відсотках до контролю.

Виділення загальної РНК та ПТ-ПЛР у реальному часі

Загальну РНК виділяли з лобової кори за допомогою міні-набору RNeasy для мозку та ліпідної тканини (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія, США). кДНК готували із загальної РНК із використанням високопродуктивного набору архівів кДНК (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США). Рівні мРНК cPLA2, sPLA2, iPLA2, COX-1 та COX-2 вимірювали за допомогою кількісної RT-PCR в реальному часі, використовуючи систему виявлення послідовності ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США). Конкретні праймери та зонди для аналізів експресії генів cPLA2, sPLA2, iPLA2, COX-1 або COX-2 (Applied Biosystems) складалися з 20-кратної суміші немечених праймерів ПЛР та зонда для зв’язування малих канавок Taqman (MGB). маркований барвником). Повторні зміни експресії генів визначали за допомогою методу ACCT. 37 Дані виражали як рівень цільового гена (cPLA2, sPLA2, iPLA2, COX-1 або COX-2) у тварин, позбавлених n-3 PUFA, нормалізованих до ендогенного контролю (β-глобулін) та відносно нормалізованого рівня в n- 3 PUFA (калібратор), як описано вище. 30, 38 Всі експерименти проводили двічі у трьох примірниках.

Діяльність фосфоліпази А 2

Статистичний аналіз

Дані виражаються як середнє значення ± сем. Статистичну значимість обчислювали за допомогою подвійного непарного t-тесту із значенням, встановленим для P 10 15 тижнів депривація n-3 PUFA значно знизила (27%) концентрацію DHA (12 ± 0,4 мкмоль/г мозку) лобової кори порівняно з концентрація v n-3. 3 щури, що відповідають PUFA (19 ± 0,5 мкмоль/г мозку) (P = 0, 0001).

позбавлення n-3 PUFA знижує активність iPLA2, білка та мРНК

П'ятнадцять тижнів позбавлення n-3 PUFA у щурів суттєво знизили активність лобової кори iPLA 2 (21%) (рис. 1а) порівняно з щурами, що відповідали n-3 PUFA. Це зменшення супроводжувалось зменшенням білка iPLA2 на 27% (рис. 1b) та зменшенням мРНК iPLA2 на 50% порівняно з щурами, що відповідали n-3 PUFA (рис. 1c).

дієтою

Діяльність IPLA2 ( a ), рівень білка b ) та рівні мРНК ( c ) у лобовій корі n-3 PUFA адекватно і позбавлений щурів. Активність IPLA2 у n-3 PUFA адекватних (n = 10) і n-3 PUFA, позбавлених (n = 8) щурів (* P = 0,010) ( a ). Репрезентативні рівні імуноблотів та білка iPLA2 у адекватних n-3 PUFA (n = 10) та щурів, позбавлених PU-PUFA (n = 10) (* P = 0,024) ( b ). Рівні мРНК IPLA2 у n-3 PUFA адекватних (n = 5) та n-3 PUFA (n = 6) щурів (* P = 0,021) ( c ). Дані порівнювали за допомогою непарних тестів, середнє значення ± сем

Повнорозмірне зображення

позбавлення n-3 PUFA збільшило активність cPLA2 та sPLA2, білка та мРНК

Активність CPLA2 була суттєво збільшена (83%) у лобовій корі щурів щурів n-3 PUFA порівняно з щурами, що відповідали n-3 PUFA (рис. 2а). Це збільшення супроводжувалося значним збільшенням білка (22%) (рис. 2b) та експресії мРНК cPLA2 (в 4 рази) (рис. 2c) порівняно з щурами, які адекватні n-3 PUFA. Подібно до cPLA2, 15 тижнів позбавлення PUFA n-3 значно збільшили активність sPLA2 (25%) (рис. 2г), білка (36%) (рис. 2д) та експресію мРНК (у 4,6 рази) (рис. 2е) порівняно з n- 3 щури, достатні для PUFA.

активність cPLA2 ( a ), рівень білка b ), рівні мРНК ( c ) та діяльність sPLA2 ( d ), рівень білка e ) та рівні мРНК ( f ) у фронтальній корі щурів, позбавлених n-3 PUFA та n-3 PUFA. активність cPLA2 у n-3 PUFA адекватних (n = 10) та n-3 PUFA, позбавлених (n = 8) щурів (* P = 0,022) ( a ). Репрезентативні імуноблоти та рівні білка cPLA2 адекватних n-3 PUFA (n = 10) та щурів, позбавлених n-3 PUFA (n = 10) (* P = 0,010) ( b ). рівні мРНК cPLA2 n-3 PUFA адекватно (n = 6) та n-3 PUFA, позбавлені (n = 6) щурів (*** P = 0, 0001) ( c ). активність sPLA2 у щурів n-3 PUFA (n = 10) та n-3 PUFA (n = 8) щурів (* P = 0, 040) ( d ). Репрезентативні імуноблоти та рівні білка sPLA2 адекватних n-3 PUFA (n = 10) та щурів, позбавлених n-3 PUFA (n = 10) (* P = 0, 020) ( e ). Рівні мРНК SPLA2 у n-3 PUFA адекватних (n = 6) і n-3 PUFA (n = 6) щурів (*** P = 0, 00012) ( f ). Дані порівнювали за допомогою непарних тестів, середнє значення ± сем

Повнорозмірне зображення

Депривація n-3 PUFA знизила рівень білка COX-1 та збільшила рівень білка COX-2 та мРНК

П’ятнадцять тижнів позбавлення PU-n-3 PUFA значно знизили білок COX-1 (28%), не змінюючи його рівня мРНК (рис. 3а та b). Білок ЦОГ-2 (38%) та рівень мРНК (у 2,4 рази) були значно вищими у лобовій корі щурів, які харчувались дієтою, позбавленою н-3 ПНЖК, у порівнянні з тими, хто вживав адекватну їжу з Н-3 ПНЖК (рис. 3c оголошення).

Білок ЦОГ-1 ( a ) та рівні мРНК ( b ), Білок ЦОГ-2 ( c ) та рівні мРНК ( d ) у лобовій корі щурів, позбавлених n-3 PUFA та n-3 PUFA. Репрезентативні рівні імуноблотів і білка ЦОГ-1 у адекватних n-3 PUFA (n = 10) та n-3 PUFA (n = 10) у щурів, позбавлених потреби (* P = 0,03) ( a ). Рівні мРНК COX-1 у n-3 PUFA адекватних (n = 6) та n-3 PUFA (n = 6) щурів (P> 0,05) ( b ). Репрезентативні рівні імуноблотів і білка ЦОГ-2 у адекватних n-3 PUFA (n = 10) та щурів, позбавлених n-3 (n = 10) (* P = 0,002) ( c ). Рівні мРНК COX-2 у щурів, достатні для n-3 PUFA (n = 6) та n-3 PUFA (n = 6) щурів (* P = 0,033) ( d ). Дані порівнювали за допомогою непарних тестів, середнє значення ± сем

Повнорозмірне зображення

обговорення

Вивільнення DHA з мембранного фосфоліпіду в основному регулюється iPLA2 11, 40 (рис. 4). Збільшення періоду напіввиведення DHA у мозку щурів, позбавлених n-3 PUFA, 10, ймовірно, зумовлене зниженням активності iPLA2, як спостерігається у цьому дослідженні. Функціональний зв’язок між iPLA 2 та COX-1 закінчується. Коли різні PLA2 та COX трансфікувались у поєднанні з 293 ембріональними клітинами нирок людини, iPLA2 не вдалося зв’язатись з COX-2, виміряним затримкою біосинтетичної реакції PG, але в парі з COX-1. Зниження експресії білка iPLA2 у щурів, позбавлених n-3 PUFA, відповідало зменшенню експресії білка COX-1. Однак не відбулося значних змін у мРНК COX-1 у мРНК n-3 PUFA щурів. Це свідчить про те, що зміни COX-1 були опосередковані після транскрипції.

Схематичне зображення взаємодій у каскадах AA та DHA. Мембранні фосфоліпіди гідролізуються cPLA2 або sPLA2, які вивільняють n-6 PUFA, AA та лізофосфоліпід. iPLA2 каталізує вивільнення n-3 PUFA, DHA та лізофосфоліпіду. Частина АА перетворюється на ейкозаноїди за допомогою ЦОГ-1 або 2, і виділений ДГК може інгібувати експресію мРНК ЦОГ-2 або може каталізуватися ЦОГ-2 або ліпоксигеназою (LOX), отримуючи 13-ОН-ДГК 60 або інші біоактивні агенти. метаболіти. У нашому дослідженні 15 тижнів n-3 PUFA зменшували депривацію DHA мозку та експресію iPLA2, одночасно збільшуючи експресію cPLA2, sPLA2 та COX-2. Детальніше див. В огляді. 3, 61 * Цей процес може відбуватися через метаболіт DHA. PL = фосфоліпід.

Повнорозмірне зображення

Кілька досліджень показали перехресне обговорення між cPLA 2 і sPLA 2. cPLA2 регулює sPLA2-залежну продукцію AA та PGE2 в індукованих ліпополісахаридами активованих макрофагах 17 та в остеобластичних клітинах, дефіцитних sPLA2. 47 cPLA2 регулює експресію sPLA2 та функцію в клітинах фібробластів. 16 інгібіторів cPLA2 блокують опосередковане sPLA2 вивільнення АА в макрофагах 48, а дані, отримані від клітин мезангіальних щурів та клітин астроцитоми людини, вказують на те, що sPLA2 може активувати cPLA2 через сигнальний шлях PKC/Raf-1/MAPK. 18, 19 У цьому дослідженні депривація DHA у мозку значно збільшила активність cPLA2 та sPLA2, білка та мРНК. Оскільки PLA2 регулює вивільнення/переробку АА з фосфоліпідів, підвищення cPLA2 та/або sPLA2 може пояснити збільшення арахідоноїлу-CoA мозку, яке спостерігається після 15 тижнів позбавлення n-3 PUFA. 10 Подальші дослідження, що вивчають кінетику АА у щурів, позбавлених PUFA n-3, є обов’язковими для перевірки того, чи підвищений метаболізм АА.

Дієта з низьким вмістом ПНЖК n-3 асоціюється з підвищеним ризиком розвитку біполярного розладу 49, а доповнення ПНЖК n-3 покращує деякі симптоми біполярного розладу. Терапевтично еквівалентні рівні антиманіакальних препаратів (літію, карбамазепіну та вальпроату) зменшували оборот АА, але не ДГК у фосфоліпідах щурів. 34, 50, 51, 52, 53 Здатність літію та карбамазепіну робити це пояснюється їх здатністю зменшувати транскрипцію cPLA2 та активність у мозку щурів, 34, 38, 50, 54, тоді як вальпроат, ймовірно, націлений на довголанцюговий ацил- CoA. синтетази. Всі три препарати знижували активність ЦОГ-2 та PGE2 мозку у щурів. 38, 50, 56, 57 П’ятнадцять тижнів депривації n-3 PUFA збільшують рівень депресії та агресивності у щурів, поведінка яких відповідає біполярному розладу у людей. Підвищений рівень cPLA2 та COX-2 у щурів, позбавлених n-3 PUFA, у цьому дослідженні суперечить тому, що повідомлялося про протимікробні препарати, і підтверджує гіпотезу про те, що ці ферменти є мішенню цих препаратів. Крім того, індукція нейрозапалення у гризунів збільшує експресію cPLA2, sPLA2 та COX-2 у мозку. 5, 58 Підвищення рівня DHA в мозку шляхом введення в їжу n-3 ПНЖК може нормалізувати змінену сигналізацію АА при біполярному розладі та нейрозапаленні.

Нарешті, 15 тижнів позбавлення n-3 PUFA знижували експресію та активність iPLA2 та COX-1, одночасно збільшуючи активність та експресію cPLA2, sPLA2 та COX-2 у корі щурів щурів. Зниження iPLA 2 може допомогти зменшити метаболічні втрати DHA головного мозку, тим самим продовжуючи період його напіввиведення. Зміни в cPLA2 та ЦОГ-2 протилежні змінам, опублікованим після введення антиманіакального агента щурам, припускаючи, що щури, позбавлені n-3 PUFA, можуть бути більш сприйнятливими до запалення та інших мозкових порушень.