ідентифікація

  • Предмети
  • Резюме
  • Вступ
  • Результати
  • Виявлення ZooMS для виявлення залишків гомініну
  • DC1227 Мікро КТ
  • Радіовуглецевий аналіз DC1227
  • Послідовності мітохондріальної ДНК (mtDNA) зразка DC1227
  • Висновки
  • Методи
  • ZooMS
  • Комп'ютерна томографія
  • Мітохондріальний аналіз ДНК
  • Вилучення ДНК та підготовка бібліотеки.
  • Мітохондріальний захоплення та секвенування
  • Обробка та відображення послідовностей
  • Філогенетичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Файли Excel
  • Додаткові дані 1
  • Коментарі

Предмети

  • Археологія
  • Мас-спектрометрія

Резюме

Секвенування ДНК революціонізувало наше розуміння архаїчних людей у ​​середньому та верхньому палеоліті. На жаль, хоча багато палеолітичних місць містять велику кількість кісток, більшість із них не мають діагностичних характеристик, необхідних для традиційної морфологічної ідентифікації. Як результат, відновлення людських решток з плейстоцену надзвичайно рідко. Щоб уникнути цієї проблеми, ми застосували метод відбитків пальців колагену до більш ніж 2000 фрагментованих кісток з печери Денисова, Росія, щоб полегшити виявлення людських останків. В результаті нашого аналізу була ідентифікована одна гомінінова кістка (Денисова 11), підтверджена поглибленим аналізом послідовності пептидів, і виявлено, що вона несе мітохондріальну ДНК типу неандертальця. Подальші радіовуглецеві датування показали, що кістці було більше 50 000 років. Тут ми демонструємо величезний потенціал відбитків пальців колагену для ідентифікації залишків гомініну у дуже фрагментарних археологічних колективах, збільшуючи ресурси, доступні для більш широких досліджень еволюції людини.

Вступ

Викопні копалини гомінінів з печери Денисова виявились безцінними для нашого розуміння архаїчних популяцій гомінінів. Це підкреслюється винятковим станом збереженості древніх молекул ДНК у деяких кістках, відновлених на цьому місці. Наприклад, денисованська фаланга (Денисова 3) містила> 70% ендогенної ДНК, що утворює геном із високим охопленням (30x) 7. Однак, незважаючи на інтенсивні розкопки в Денисовій печері, серед тисяч відкопаних кісток було виявлено лише кілька залишків гомінінів. Виявлені зуби або невеликого розміру, як правило, фаланги, які рідше страждають на фрагментацію, що призводить до втрати діагностичних характеристик. Така фрагментація, яка зумовлена ​​як тафономією навколишнього середовища, так і м’ясоїдною чи людською діяльністю, призводить до високого відсотка костей, видобутих з цього та багатьох інших археологічних пам’яток, які неможливо ідентифікувати на основі їх морфології 3, 8. Тільки в Східній галереї Денисової печери під час розкопок між 2005 і 2013 роками було отримано приблизно 135 600 кісток; проте 128 591 не вдалося ідентифікувати 8 .

Тут ми застосовуємо метод ідентифікації видів відбитків пальців з пептидного колагену, відомий як зооархеологія за допомогою мас-спектрометрії (ZooMS), до 2315 неідентифікованих фрагментів кісток, архівованих з печери Денисова. Ці недіагностичні кістки були відібрані з матеріалів, розкопаних у східній галереї печери в 2014 році. Залишки мали розміри, як правило, від 3 до 5 см, з кістками, які були досить великими, щоб бути корисними для подальшого аналізу (тобто, аналіз радіовуглецю та ДНК). ) бажано обраний. В недалекому минулому аналіз ZooMS успішно розрізнив широкий діапазон груп ссавців, включаючи одомашнених таксонів 9, 10, диких наземних таксонів 11, 12 та морської фауни 13, а також деяких таксонів не ссавців. 13, 14. Для цього ZooMS використовує пептидні відбитки пальців для аналізу домінуючого білка в кістці, колаген типу 1 (COL1), відомого своєю довговічністю, особливо в холодному кліматі. Цей метод дав відбитки пальців колагену у зразках, що датуються

Результати

Виявлення ZooMS для виявлення залишків гомініну

Раніше опубліковані людські маркери позначаються A - G. Всі пронумеровані піки представляють підтверджені послідовності пептидів, що спостерігаються в людському колагені (крім Е, який відомий лише за схожістю з гомологічними маркерами інших видів 9).

Повнорозмірне зображення

Зразк, визначений гомініном, DC1227, був розкопаний із квадрата А-2, шар 12 Східної галереї. Перед забором кістка важила 1,68 г, максимальна довжина - 24,7 мм, ширина - 8,39 мм. Для аналізу ZooMS було взято близько 36 мг (рис. 2). Кістка виглядає цілком нічим не примітною, без будь-яких морфологічних ознак або доказів навмисної модифікації, тому її легко пропустити при остеологічному аналізі.

Повнорозмірне зображення

DC1227 Мікро КТ

Перед тим, як проводити більш руйнівні зразки для радіовуглецевого та мітохондріального ДНК-аналізу, була проведена мікрокомп'ютерна томографія (мікро-КТ). Враховуючи рідкісність такого відкриття, мікро-КТ було визнано доцільним для виявлення ділянок, які зазнали видимої деградації, і тому їх слід уникати при подальших аналізах. Результати показали, що зразок дуже щільний, без ознак деградації кісток, незважаючи на низку діагенетичних мікротріщин, які тягнуться вздовж її довжини. Три з цих субмікронних тріщин дуже близько простягаються між собою через кістку, однак вони не утворюють тріщини і, здається, не порушили структуру кістки. Сканування також підкреслило ступінь кислотного травлення та кісточок на поверхні кісток, які можуть бути результатом проходження через травну систему м’ясоїда (рис. 3). На місці виявлено низку м’ясоїдних тварин; З огляду на поширеність гієн у печері Денисова, здається ймовірним, що кістка була витравлена ​​кислотою через шлункові кислоти гієни 8, 20 .

Повнорозмірне зображення

Радіовуглецевий аналіз DC1227

57000 років 21, 22. Якщо DC1227 було виявлено in situ, очікувалося б повернення віку, що перевищує верхню межу радіовуглецевого датування (> 50 000 років).

Датування радіовуглецю проводили в Оксфордському підрозділі прискорювачів радіовуглецю (ORAU) за стандартними 23 процедурами та протоколами, давши оцінку віку> 49 900 років до н.е. кісткового колагену. Результат повністю узгоджується з виведеним геоархеологічним віком щодо стратиграфічної послідовності на цьому місці.

Вимірювання вуглецю та азоту давали значення δ 13 C −17,3 ‰ та значення δ 15 N 16,4 ‰. Гомініни в регіоні зазвичай повертають значення ізотопів азоту між 13-15 13, що показано, наприклад, серед неандертальців із печери Окладникова 24. Підвищені значення DC1227 можуть свідчити про різні харчові відхилення, включаючи дієту, багату білком, отриманим з організмів вищого трофічного рівня, таких як прісноводна риба 25, 26. Потрібні додаткові дослідження, щоб перевести підвищені ізотопні значення у належний контекст, і про це буде повідомлено в майбутньому. Такі дослідження ізотопного складу гомінідів та пов'язаної з ними фауни Денисової можуть виявити важливу інформацію про раціони палеолітичних гомінінів, що мешкають на Алтаї, і в даний час таке дослідження триває в Оксфордському університеті.

Мітохондріальна ДНК (mtDNA) Послідовності зразка DC1227

Ми витягли ДНК з 30,9 мг кісткового порошку з DC1227 27. Аликвотна частина екстракту була перетворена в одноланцюгову бібліотеку ДНК 28, яку збагатили для фрагментів мітохондріальної ДНК гомініну за допомогою 29 мітохондріальних зондів людини. Ізольовані фрагменти ДНК секвенували та картографували в Кембриджській ревізованій референтній послідовності мітохондрій людини (rCRS). Загалом ми ідентифікували 282, 502 унікальних фрагменти мтДНК, що перевищують 35 пар основ (Додаткова таблиця S1).

Щоб оцінити, чи були деякі фрагменти мтДНК давнього походження, ми скористалися тим фактом, що основи цитозину (С) на кінцях молекул ДНК мають тенденцію до дезамінування з часом 30 і в результаті зчитуються як тимін (Т) ДНК-полімерази. Старі фрагменти ДНК, вирівняні до контрольної послідовності, як правило, несуть високі частоти очевидних заміщень С на Т на своїх 5 'і 3' кінцях 31, 32, 33. З фрагментів, які починаються або закінчуються в положеннях, де основою rCRS є C, 32,2% і 31,3% несли Ts на своїх 5 'і 3' кінцях відповідно (додаткова фігура S13), що вказує на наявність старих молекул ДНК гомініну у DC1227.

Щоб визначити, чи є ендогенна мтДНК DC1227 тісніше пов’язана із сучасними геномами мітохондрій Денисована, Неандертальця чи людини, ми обмежили аналіз послідовностями, які несуть заміщення С на Т відносно rCRS на одному кінці 34, щоб зменшити вплив струму передбачуване забруднення ДНК людини (додаткова інформація). Використовуючи 36 665 таких послідовностей (Додаткова таблиця S1), мітохондріальний геном зразка DC1227 був реконструйований із середнім охопленням у 130 разів, залишивши 63 положення, охоплені двома або менше послідовностями, і чотири, де менше двох третин послідовностей несли однакові база. Тому 67 позицій не можна було назвати з упевненістю.

При порівнянні мтДНК DC1227 для завершення неандертальської мтДНК, визначеної на сьогоднішній день, вона має п'ять основних відмінностей від мтДНК Неандертальців Okladnikov 2 33, виявлених приблизно в 60 км від Денисової печери, 12-17 відмінностей від неандертальців із Західної та Південної Європи та 31 Мезмайська 1 із Кавказу 35 та неандерталець, знайдений у Денисовій печері 5. Для порівняння, мтДНК DC1227 відрізняється між 174 та 354 основами щодо мтДНК інших груп гомінінів (Додаткова таблиця S2). Під час філогенетичного аналізу (рис. 4) геном мітохондрій DC1227 потрапляє в діапазон десяти неандертальців, за винятком 311 нинішніх людей, десяти стародавніх сучасних людей, двох денизованців та одного гомініна із середнього плейстоцену Іспанії. Ми прийшли до висновку, що особина DC1227 несла мітохондріальний геном типу неандертальця і ​​називатимемо його далі Денісова 11.

В якості зовнішньої групи використовували мтДНК шимпанзе (не показано). Підтримка кожної гілки базується на 500 завантажувальних репліках. Див. Таблицю S2 щодо географічного походження давніх зразків.

Повнорозмірне зображення

Висновки

Методи

ZooMS

Від кожної з кісток у складі брали від 20 до 50 мг кістки і демінералізували в 0,6 М соляній кислоті (HCl) протягом 18 годин. Отриманий залишок видаляли на ультрафільтрах з відсіканням молекулярної маси 30 кДа (MWCO) і центрифугували при 3700 об/хв протягом 1 години. Фільтрат двічі промивали 500 мкл 50 мМ бікарбонату амонію (AmBic) і центрифугували при 3700 об/хв протягом півгодини після кожної обробки. Остаточний залишок ресуспендували додатково AmBic (200 мкл), половину якого видаляли для створення резервного набору зразків перед перетравленням. Решта 100 мкл потім обробляли 0,2 мкг трипсину (клас секвенування; Promega UK) та інкубували при 37 ° С протягом 18 годин. Потім отриманий розчин змішували з матричним розчином 1 мкл розчину α-ціано-4-гідроксикилотної кислоти (10 мг/мл у 50% ацетонітрилі (ACN)/0,1% трифтороцтової кислоти (TFA)), даючи змогло кристалізуватися та аналізували за допомогою мас-спектрометра MALDI Tof/Tof Bruker Ultraflex II (Bruker Daltonics, Бремен). Отримані мас-спектри були обрані для людських маркерів 9, 12 за допомогою програмного забезпечення FlexAnalysis.

Комп'ютерна томографія

Комп’ютерну томографію проводили з використанням мікросканера Nikon XT H 225 з мішенню передачі. Були зроблені спроби зберегти дозу якомога нижчою, щоб уникнути пошкодження зразка, тому сканування проводили при 70 кВ та 80 мкА. Загалом за проекцію було зроблено 1448 двокадрових проектів з експозицією 100 мс та збільшенням × 7,2. Дані реконструювали за допомогою програмного забезпечення CT Pro 3D та обробляли за допомогою програмного забезпечення VG Studio Max 2.1.

Мітохондріальний аналіз ДНК

Вилучення ДНК та підготовка бібліотеки.

З DC1227 за допомогою стоматологічної бормашини видалено 30,9 мг кісткового порошку. ДНК витягували за допомогою протоколу на основі діоксиду кремнію, призначеного для відновлення коротких молекул ДНК 27, 36. 10 мкл екстракту ДНК (E3128) перетворювали в одноланцюгову бібліотеку ДНК (A9301), як описано 28, 36. Кількість молекул ДНК у бібліотеці оцінювали за допомогою цифрової краплинної ПЛР (BioRad QX 200), використовуючи 1 мкл як вхід для аналізу EvaGreen (BioRad) з праймерами IS7 та IS8 37. Бібліотека була штрих-кодована двома унікальними індексами 36, 38 і підсилювалась за допомогою ДНК-полімерази AccuPrime Pfx (Life Technologies) 39. Продукти ампліфікації очищали за допомогою набору для очищення ПЛР MinElute (Qiagen); і визначено кількісно на фотопектрометрі NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies).

Мітохондріальний захоплення та секвенування

Ампліфікована бібліотека (A9317) була збагачена протоколом 29 захоплення гібридизації на основі мікросфери з використанням одномозкової пари мозаїки, розроблених 52 зондами 40 mer 40 в rCRS (посилання NCI Національного центру біотехнологічної інформації [NCBI]) у два раунди захоплення, використовуючи 1 мкг та 0,5 мкг вхідної ДНК відповідно. Захоплену бібліотеку (L5502) секвенували на платформі MiSeq (Illumina), використовуючи пари прогонів (2 × 76 циклів) із конфігурацією подвійного індексу 38. Екстракційну заготівлю ДНК та заготовку для бібліотеки проводили протягом усієї процедури як негативні контролі.

Обробка та відображення послідовностей

Базовий дзвінок був здійснений за допомогою дрохви (Illumina). Послідовності адаптера були обрізані, а пряме та зворотне зчитування об'єднані в окремі послідовності 41. Послідовності, в яких не вистачало ідеальних збігів із очікуваними штрих-кодами, були відкинуті. Нанесення на еталонний геном проводили за допомогою BWA 42, з параметрами "-n 0,01 -o 2 -l 16500" 7. Дублікати ПЛР видаляли шляхом злиття послідовностей з однаковими координатами початку та кінця вирівнювання, використовуючи bam-rmdup (//github.com/udo-stenzel/biohazard). Послідовності понад 35 основ з якістю відображення більше 30 були збережені для подальшого аналізу.

Філогенетичний аналіз

Для реконструкції мтДНК DC1227 використовували послідовності, що несуть кінцеві заміщення на Т. Термінали Ts в першому або останньому положенні кожної послідовності були перетворені в N, щоб зменшити вплив помилок послідовності, отриманих від пошкодження, на виклики консенсусу. База консенсусу визначалася, якщо позиція охоплювалася принаймні трьома послідовностями, і якщо принаймні 67% послідовностей, тобто більше двох третин, що перекриваються, несли однакову базу 34 .

МтДНК вирівнюється з мтДНК 311 сучасних людей 43, 10 стародавніх сучасних людей 31, 44, 45, 46, 47 десяти неандертальців 5, 33, 35, 48, 49, двох денисовців 3, 4 середнього плейстоцену гомініну 34 і шимпанзе (Pan troglodytes, NC_001643) 50 від MAFFT 51. Кількість базових відмінностей між послідовностями та деревом Neighbors Union з 500 завантажувальними репліками 52 на основі цих відмінностей було отримано за допомогою MEGA6 53 .

Додаткова інформація

Як цитувати цю статтю: Браун, С. та ін. Ідентифікація нової кістки гомініну з печери Денисова, Сибір, за допомогою відбитків пальців колагену та аналізу ДНК мітохондрій. Науковий співробітник. 6, 23559; doi: 10.1038/srep23559 (2016).

Код доступу: послідовність мітохондріального геному зразка DC1227 (Денисова 11) була депонована у GenBank (номер приєднання KU131206).