предметів
реферат
Підшкірні та внутрішньом'язові жирові відкладення є важливою характеристикою оцінки варених яловичих продуктів. Мармуровість, визначена як внутрішньом’язовий вміст жиру, сприяє ніжності м’яса, соковитості та смаку, які важливі для якості яловичини. Загалом підшкірна клітковина має пріоритет для наповнення адипоцитами, а потім внутрішньом’язовими ділянками, що призводить до меншої секреції мармуру. Зменшення підшкірного жиру та покращення накопичення внутрішньом’язових ліпідів у сучасному виробництві яловичини залишається основною проблемою 1. Адипогенез, процес диференціації преадипоцитів у адипоцити, відіграє вирішальну роль у накопиченні жирової тканини у тварин 2, 3. Точне розуміння молекулярних механізмів зберігання яловичого жиру має важливе значення для виробництва високоякісної вареної яловичини.
В останні роки все частіше використовується глибоке секвенування транскриптомів для ідентифікації диференційовано експресованих мікроРНК, а також можливість виявлення нових транскриптів, включаючи нові альтернативні ізоформи та мікроРНК 4, 5, 6, 7. З бурхливим розвитком послідовності наступного покоління (NGS) дослідження мікроРНК стає більш досяжним, ніж раніше 8, 9, 10, 11. Відкладення жиру - це складний біологічний процес, де мікроРНК можуть відігравати регуляторну роль. У жировій тканині накопичувані докази чітко вказують на те, що мікроРНК відіграють важливу роль у диференціації адипоцитів та метаболізмі ліпідів 12, 13. Встановлено, що багато мікроРНК, такі як let-7 14, miR-143 15, 16, 17, miR-17-5p 18, miR-14 19 та miR-33 20, 21, 22, регулюють диференціацію адипоцитів та ліпогенез за допомогою різних сигналів шляхи, включаючи Wnt, MAPK, регуляцію клітинного циклу та шляхи інсуліну. Ядерні рецептори, такі як білки CCAAT/енхансер-зв'язуючий (C/EBP), рецептор, що активується проліфератором пероксисоми (PPAR), і елементи стеролу, що регулюють зв'язуючі білки (SREBP), також важливі. Ці висновки дозволяють припустити, що міРНК можуть брати участь у накопиченні бичачих ліпідів у жировій тканині та м’язах.
Це виявилося життєздатною стратегією дослідження механізмів адипогенезу та накопичення жирової тканини шляхом порівняння моделей експресії міРНК та/або мРНК між різними породами великої рогатої худоби. Ван та співавт. 23 порівнює модель внутрішньом’язової експресії гена жиру між гібридами Wagyu × Hereford та Piedmontese × Hereford та набором генів, пов’язаних з адипогенезом та ліпогенезом, таких як адипонектин (ADIPOQ), дезатураза стеароїл-КоА (SCD) та індуктор гормону щитовидної залози. білка (THRSP), регулювались вгору в групі Wagyu × Hereford 23. В іншому дослідженні також порівнювали профілі експресії мікроРНК підшкірної жирової тканини з декількох гібридів у гілці 24. Порівняння чистопородної худоби з різними характеристиками зберігання жиру дасть деяку нову інформацію про роль різних міРНК.
Велика рогата худоба Вагю славиться своєю високою мармуровістю, тобто високим рівнем внутрішньом'язового накопичення ліпідів, тоді як інша відома ферма великої рогатої худоби, голштинська худоба, має набагато менше мармуровості порівняно з Ваг'ю 25, 26. Різниця у сховищі жиру між великою рогатою худобою Вагю та Гольштейном привертає велику увагу при дослідженні порівняльного механізму в галузі адипогенезу та ліпогенезу великої рогатої худоби. Попередні дослідження, присвячені різниці у зберіганні жиру між худобою Wagyu та голштинськими, зосереджувались головним чином на диференціальній експресії специфічних генів, таких як SCD 27 та преадипоцитарний фактор 1 (Pref-1) 25. На сьогоднішній день невідома різниця у схемі експресії мікроРНК між яловичиною Ваг'ю та Гольштейном. У цьому дослідженні було проведено скринінг високопродуктивної послідовності для порівняння рівнів експресії мікроРНК підшкірної жирової тканини між Wagya та Holstein. Наша мета - виявити можливі регулятори мікроРНК накопичення жирової тканини та надати нові уявлення про можливі механізми накопичення бичачого жиру.
результат
Побудова невеликих бібліотек РНК
Для виявлення жирових диференційовано експресованих мікроРНК у зворотному зростанні між худобою Wagyu (W) та Гольштейном (H) ми створили невеликі бібліотеки РНК W та H. За допомогою секвенування Illumina із бібліотек W та H. було отримано загалом 12 435 335 та 10 962 269 необроблених даних. Після низькоякісних послідовностей, polyA, послідовності, коротші за 18 або довші ніж 45 nt, та повторювані послідовності, 10, 974, 628 (88, 32 %) та 9, 417, 372 (85, 96%) чистих показань у бібліотеках W та H були нарешті отримані для подальшого аналізу (табл. 1). Невеликий розподіл довжини РНК у двох бібліотеках показав, що найбільш поширені види були довжиною 21-22 нт, що є типовим діапазоном розмірів для продуктів, що отримуються Dicer (рис. 1). Потім ці очищення узгоджували з базою даних Rfam, щоб відфільтрувати некодирующие РНК, такі як тРНК, рРНК, сноРНК та snRNA. Загалом, 35, 28% та 33, 46% різних значень загальних малих РНК у бібліотеках W та H були визначені як збережені мікроРНК, що вказує на те, що секвенування у цьому дослідженні було успішним (рис. 2).
Стіл в натуральну величину
Повнорозмірне зображення
Повнорозмірне зображення
Далі відфільтровані лічильники вирівнювали з геномом великої рогатої худоби і відібрали послідовності miRNA, щоб BLAST проти miRBase ідентифікували збережені miRNA і обчислювали рівні їх експресії. 208 збережених міРНК були успішно ідентифіковані як в бібліотеках W, так і в H. Крім того, 48 мікроРНК спеціально експресувались у задньому жирі голштинської худоби, а 14 мікроРНК - лише у великої рогатої худоби Ваг'ю (рис. 3). Послідовності, які не відповідали збереженим міРНК, використовувались для потенційного прогнозування нових міРНК. Аналіз значень транскриптів на мільйон (TPM) показав, що в бібліотеках W і H перші десять мікроРНК з великим числом складали 60% від загальної кількості мікроРНК, включаючи let-7 14, miR-143 15, 16, 17, miR-21-5p 28, miR-27b 29, 30, 31 та miR-378 32, які, як кажуть, раніше брали участь у диференціації адипоцитів (рис. 4).
Повнорозмірне зображення
Повнорозмірне зображення
Диференціально виражений аналіз мікроРНК між великою рогатою худобою Ваг'ю та Гольштейном
У цьому дослідженні секвенування рівень експресії miRNA, який виражався в обох бібліотеках, визначався кількісно за допомогою TPM, якщо TPM з | log2FC | ≥ 1 та значення рД, скореговане для FDR
Повнорозмірне зображення
Анотація шляхів GO та KEGG генів-мішеней міРНК
Аналіз взаємодії міРНК і білка
Мережа взаємодії мікроРНК та білка була побудована для виявлення взаємозв'язку передбачуваних генів-мішеней у сигнальному шляху PPAR, а мікроРНК спрямовували на ідентифікацію потенційних регуляторів (рис. 6). Відповідно до даних, показаних на фіг. 5 результатів показують, що PPARα та RXRα відігравали центральну роль у сигнальному шляху PPAR і можуть бути цілями, регульованими bta-miR-196b та bta-miR-874.
Повнорозмірне зображення
Валідація послідовності мікроРНК за допомогою qPCR
Рівень експресії 4 диференційовано експресованих miРНК був відібраний та перевірений за допомогою qRT-ПЛР (рис. 7). Відповідно до даних секвенування miRNA, результати qRT-PCR з 4 випадково відібраних miRNA показали подібний зразок експресії в двох бібліотеках, ще більше підтверджуючи, що наші дані послідовності були надійними.
Порівняння значень відносного виразу ( A ) і TPM ( B ) з чотирьох вибраних диференціально експресованих міРНК. ( A ) Відносний рівень експресії вибраних мікроРНК вимірювали за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі, дані виражали як середнє значення ± SD. **, *** стор.35. Однак їх точна роль мікроРНК у відкладенні бичачого жиру далеко не ясна. У цьому дослідженні ми провели високопродуктивне секвенування РНК, щоб ідентифікувати мікроРНК, пов’язані з різними властивостями накопичення жиру між великою рогатою худобою Ваг’ю та Гольштейном. У цьому дослідженні ми виявили, що рівні експресії miR-142-3p, miR-379 та miR-196a були вищими в жировій тканині великої рогатої худоби Wagyu порівняно з Гольштейном (табл. 2). Дослідження Chartoumpekis et al. (2012) та Meale та ін. (2014) також повідомляли, що ці мікроРНК регулюють ліпогенез та накопичення жиру у інших тварин 36, 37. Загалом, це дослідження показує, що більш високий рівень внутрішньом’язового жиру у великої рогатої худоби Wagyu може бути частково пов’язаний з цими 3 сильно вираженими мікроРНК.
Цікаво, що bta-miR-320a також був представлений у першій десятці дуже рясних мікроРНК і продемонстрував суттєво інший профіль експресії між худобою Wagyu та Holstein (P 38. Сім'я MiR-320 сприяє адипогенезу, блокуючи диференціацію інших MSC (тобто остеобластів) Ще одне дослідження також виявило, що miR-320 регулює резистентність до інсуліну через сигнальний шлях інсуліну-PI3K 39. Поряд з нашим нинішнім результатом, miR-320 відіграє важливу роль в адипогенезі та, як наслідок, різниця в накопиченні жиру між великою рогатою худобою Ваг'ю та Голштейном.
Крім того, ми виявили, що рівні експресії miR-136, miR-190a, miR-411a, miR-708, miR-1940 та miR-2887 були значно вищими у Ваг'ю порівняно з великою рогатою худобою Голштейна (P 40. Сигнальний шлях Notch є ключовим шляхом в онтогенезі та диференціації клітин 41. Кілька попередніх досліджень вказували на роль шляху Notch у диференціації перед адипоцитами та припускали, що активація сигнального шляху Notch може інгібувати диференціацію адипоцитів 42, 43, 44, 45. У цьому дослідженні 8 цільових генів miRNAs, включаючи дельта-подібний білок 1 (DLL1), гомологічний білок гомолога сегмента полярності DVL-3 (DVL3), ацетилтрансфераза гістону KAT2A (KAT2A), субодиниця гамма-секретази PEN-2 (PSENEN), фактор транскрипції HES-5 (HES5)), гистондеацетилаза 1 (HDAC1), E3 убиквитин-білкова лігаза DTX4 (DTX4) і E3 убиквитин-білкова лігаза DTX2 (DTX2) були задіяні в сигнальному шляху Notch, припускаючи, що деякі мікроРНК регулюють диференціювання адипоцитів шлях Notch.
висновок
У цьому дослідженні ми використовували високопродуктивне секвенування малих РНК для порівняння рівня мікроРНК зворотного жиру між великою рогатою худобою Ваг'ю та Гольштейном. Виходячи з наших висновків, це перше дослідження профілів мікроРНК жирової тканини між великою рогатою худобою Вагю та Гольштейном, щоб дослідити можливі механізми накопичення жиру. У нашому дослідженні виявлено кілька мікроРНК, які можуть регулювати адипогенез за допомогою своїх цілей та пов’язаних шляхів. Серед них регульований вгору bta-miR-196b та знижений bta-miR-874 можуть впливати на трансляцію сигналу шляху PPAR своїми цілями, що беруть участь у шляху, і згодом регулювати накопичення жиру. Наші результати дають інформацію про мікроРНК, які диференційовано експресуються в підшкірному жирі двох різних порід великої рогатої худоби з різним рівнем осадження мармуру, забезпечуючи краще розуміння молекулярних механізмів відкладення бичачого жиру.
Матеріали і методи
Експериментальні тварини та підготовка проб
Усі експерименти проводились згідно з відповідними директивами та правилами, поданими до Міністерства сільського господарства Китайської Народної Республіки. Всі експериментальні протоколи були затверджені Інститутом наук про тварин Китайської академії сільськогосподарських наук, де проводився експеримент.
У цьому дослідженні велику рогату худобу Ваг’ю та Голштейн забезпечували компанія Beijing Huairou Wagyu Technology CO (Пекін, Китай) та компанія з виробництва м’яса Langfang Xingcheng (Хебей, Китай). Для збору дорсальної підшкірної жирової тканини між 12-м і 13-м ребрами було відібрано п’ять самців ваг’ю та п’ять самців голштинської худоби віком близько 30 місяців. Жирову тканину видаляли відразу після вбивства тварин і негайно зберігали в рідкому азоті для подальшого вилучення РНК.
Побудова та послідовність невеликих бібліотек РНК
Загальну РНК екстрагували з жирової тканини за допомогою TRIzol (Invitrogen, США) згідно з інструкціями виробника. Аликвоти загальної РНК (10 мкг) від п’яти худоби Wagyu або Гольштейна змішували в рівних кількостях, утворюючи збірну пробу у вигляді бібліотеки W (для великої рогатої худоби Wagyu) та H (для великої рогатої худоби Гольштейна). Загальну концентрацію РНК вимірювали за допомогою спектрофотометра NanoDrop 2000 (система GE, США) та біоаналізатора Agilent 2100 (система GE, США). Невеликі РНК виділяли за допомогою PEG-8000 (Sigma, США), РНК лігували за допомогою 3 'адаптера, а потім фракціонували на розмір 15% шляхом денатураційного електрофорезу в поліакриламідному гелі. Отримували фракції від 36 до 44 нт і прив'язували до 5'-адаптера. Невеликі фракції РНК транскрибували зворотно, а потім ампліфікували за допомогою ПЛР, амплікони завантажували на 3,5% агарозний гель, фракції 140-160 п.н. отримували як бібліотеку. Невеликі бібліотеки РНК перевіряли qPCR і концентрація перевищувала 2 нМ, що вказує на надійність бібліотек. Потім бібліотеки W та H послідовно використовували Hiseq-2000.
Біоінформатичний аналіз малих послідовностей РНК
Неопрацьовані зчитування, отримані з бібліотек, спочатку оброблялися за допомогою програмного забезпечення Cutadapt та набору інструментів FASTX для отримання чистого зчитування у файлах FASTQ. Оцінку якості даних послідовностей, включаючи розподіл бази, коефіцієнт ГХ, дублювання ПЛР та частоту деформацій, оцінювали за допомогою програмного забезпечення FastQC. Функція FASTQ Information в наборі інструментів FASTX була використана для аналізу розподілу довжини послідовностей РНК. Чисті малі послідовності РНК довжиною від 18 до 45 нт, отримані з бібліотек, порівнювали з базою даних Rfam (Rfam 10.0), використовуючи Rfamscan та Blastn для видалення рРНК, сРНК, snRNA, snoRNA та тРНК 51. Решта різних послідовностей використовувались для пошуку miRBase (miRBase19.0) за допомогою miRDeep2 для ідентифікації збережених miRNA 52, 53. Для прогнозування нових кандидатів на miRNA послідовності картографували в геномі великої рогатої худоби з ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-76/fasta/bos_taurus/dna/ за допомогою bowtie2 та обчислювали miRDeep2.
Диференціально виражена ідентифікація міРНК та прогнозування цілі
Для аналізу виразу 54 використовували кількість збережених miRNA, виявлених за допомогою miRDeep2 між бібліотеками W та H. Для оцінки значущості різниці у вираженні miRNA для обчислення набору даних підрахунку використовували програму "edgeR" 55 для пакету R. Варто зазначити, щоб уникати помилково позитивних результатів, лише TPM s | log2FC | ≥ 1 та значення коефіцієнта коефіцієнта полегшення шуму, відрегульоване 56 .
Генетична онтологія (GO) та анотація Кіотської енциклопедії генів і геномів (KEGG) генів-цільових miRNA та аналіз взаємодії miRNA-білка
GO-аналіз екранованих генів-цільових мікроРНК проводили для прогнозування потенційних біологічних процесів та функцій, на які найімовірніше впливає мікроРНК, використовуючи Базу даних анотацій, візуалізації та інтеграції (DAVID) 57. Найважливіші категорії ГО, біологічні функції та різні канонічні шляхи були проаналізовані на специфічні для міРНК цілі, а також на всі тестовані мішені на основі значної надмірної експресії генів за допомогою тесту Фішера. Потім цільові гени miRNA були анотовані у шляху KEGG за допомогою DAVID 58. Крім того, ми використовували базу даних String (//string-db.org/) для прогнозування мережі взаємодії miRNA-mRNA цільового гена.
qPCR перевірка ідентифікованих міРНК
Рівні експресії 3 диференційовано експресованих miРНК, bta-miR-320a, bta-miR-874 та bta-miR-1247-3p, та передбачувана нова miRNA chr4_8522 були випадковим чином відібрані та перевірені за допомогою qRT-PCR. Коротко кажучи, загальна РНК, витягнута з бичачого жиру, була зворотно транскрибована для отримання кДНК. Потім проводили ПЛР-реакцію в реальному часі для вимірювання рівнів експресії міРНК. Всі реакції проводили в трьох примірниках з реакційним об'ємом 10 мкл (5 мкл 2 х LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix, 0,2 мкл ПЛР-праймера, 0,2 мкл ПЛР-зворотного праймера, 1 мкл кДНК і 3,6 мкл нуклеази). H 2 O) та інкубують (95 ° C протягом 10 хвилин, потім 40 циклів при 95 ° C протягом 10 секунд, 60 ° C протягом 30 секунд). Для порівняння рівня відносної експресії генів використовували порівняльний метод Ct та внутрішній контроль гена miRNA U6. Усі реакції qPCR давали один пік на кривій дисоціації, вказуючи на конкретні ампліфікації.
Статистичний аналіз
TPM використовували для оцінки рівнів експресії міРНК і розраховували за формулою. У формулі бібліотезація представляє загальну кількість усіх ідентифікованих miRNA, а miR_readscounts вказує кількість конкретних miRNA.
При обробці аналізу збагачення цільового гена, гіпергеометричний розподіл та точний аналіз Фішера використовувались для обчислення р-значень, використовуючи формулу нижче. У формулі a представляє кількість генів-мішеней у GO-терміні або шляху, що підлягає виявленню, b представляє нецільові гени, кількість нецільових генів замінює кількість нецільових генів того самого терміна, c представляє кількість генів-мішеней у наступні терміни, тоді як d являє собою кількість нецільових генів в інші дати. Оскільки це багаторазовий тест, значення р коригуються методом швидкості помилкового виявлення (FDR).
Всі дані qPCR представлені як середнє значення ± SD. Коли проводили порівняння, t-тест Стьюдента проводили за допомогою SPSS 17, 0 (IBM, США) та с