макрофагами

  • Предмети
  • Резюме
  • Вступ
  • Результати
  • Вираз жирова тканина при ожирінні.
  • Змінений розподіл ліпідів у мишей Мінкл КО
  • Покращує метаболізм глюкози у мишей Мінкл КО
  • Зменшення фіброзу жирової тканини у мишей Мінкл КО
  • Зменшення утворення CLS в жировій тканині мишей Мінкл КО
  • Експресія фіброгенного гена, стимульована мінкле у макрофагах
  • Збільшення міофібробластів, стимульованих мінілетом у SVF
  • Міжклітинний інтерстиціальний фіброз у жировій тканині
  • Обговорення
  • Методи
  • Реагенти
  • Тварини
  • Гістологічний аналіз
  • Гібридизація в якщо ти
  • Проточний цитометричний аналіз.
  • Конфокальний мікроскопічний аналіз
  • Вміст колагену в жировій тканині
  • Вміст тригліцеридів у печінці
  • Тести на толерантність до глюкози та інсуліну
  • Вестерн-блот Akt
  • Аналіз сироватки
  • TDM стимуляція
  • Кількісна ПЛР у режимі реального часу
  • Аналіз мікрочипів
  • Експерименти з БМТ
  • статистичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • Приєднання
  • Експресія гена омнібуса
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

Предмети

  • Моноцити та макрофаги
  • Ожиріння
  • Патогенез

Резюме

Вступ

Як місце перехресних зв’язків між адипоцитами та макрофагами, в ожиріній жировій тканині існує унікальна структура, яка називається коронкоподібною структурою (CLS), де макрофаги, як вважають, видаляють залишкові краплі ліпідів з мертвих адипоцитів 9, 10. Гістологічно прозапальні макрофаги М1 агрегуються, складаючи CLS у жировій жировій тканині людей та гризунів. З іншого боку, макрофаги М2 розкидані в інтерстиціальних просторах між адипоцитами 10. Зокрема, кількість CLS позитивно корелює із системною резистентністю до інсуліну у осіб із ожирінням, 11, 12, що свідчить про патофізіологічну роль CLS у запаленні жирової тканини та системному енергетичному обміні. Однак спосіб утворення CLS в жировій тканині під час ожиріння та те, як він бере участь у реконструкції жирової тканини, недостатньо вивчений.

Лектин типу C, індукований макрофагами (Mincle, Clec4e або Clecsf9), є датчиком збудника, який розпізнає патогенні гриби та Mycobacterium tuberculosis 13, 14, 15, 16, і, як випливає з назви, він індукується в макрофагах ліпополісахаридом a через Toll- як рецептор 4 (TLR4; посилання 17). Раніше ми повідомляли, що насичені жирні кислоти також індукують експресію Mincle у макрофагах через TLR4 (посилання 18). Крім того, індуковане ожирінням збільшення експресії Mincle в жировій тканині помітно послаблюється у мишей C3H/HeJ з дефектним сигналом TLR4 щодо контрольних мишей C3H/HeN 18. Ямасакі та ін. повідомив, що Mincle також може виявити загибель клітин, щоб індукувати прозапальну продукцію цитокінів, і запропонував роль Mincle у стерильному запаленні 19. Нещодавно ми показали, що Mincle індукується в макрофагах жирової тканини під час взаємодії між адипоцитами та макрофагами, принаймні частково, шляхом насиченої жирної кислоти/TLR4/NF-κB. В даний час незрозуміло, чи регулює Мінкл запалення жирової тканини і, отже, системний метаболізм енергії при ожирінні, і якщо так, то як це робиться, залишається з’ясувати.

Тут ми показуємо, що Мінкл, індукований під час розвитку ожиріння, локалізується в макрофагах, які складають CLS в жировій тканині. Цікаво, що миші Mincle KO захищені від утворення CLS, спричиненого ожирінням, та фіброзу жирової тканини з подальшим меншим накопиченням ектопічних ліпідів та резистентності до інсуліну в печінці. З іншого боку, лікування трегалозою-6,6'-димілатом (TDM), гліколіпідом клітинної стінки мікобактерій, який, як відомо, є лігандом Mincle 13, індукує утворення CLS та інтерстиціальний фіброз у жировій тканині у мишей. . Стимуляція мінкле також індукує потужну експресію генів, пов’язаних з фіброзом, у макрофагах in vitro. Це дослідження наводить докази того, що Mincle відіграє роль у перехресних зв’язках між адипоцитами та макрофагами в CLS, що призводить до активації фіброгенної програми. Наші дані також свідчать про те, що антагонізм Мінкле в макрофагах пропонує нову терапевтичну стратегію для запобігання або лікування індукованого ожирінням фіброзу жирової тканини і, отже, накопичення позаматкових ліпідів.

Результати

Вираження жирової тканини при ожирінні.

( до ) Часовий хід експресії мРНК Mincle та Emr1 (F4/80) в жировій тканині епідидиму мишей дикого типу, яких годували HFD або SD протягом 50 тижнів. Значення є середніми ± сем. Дані аналізуються неспареним t-критерієм; n = 5-11; † P †† P § P §§ P -, CD45 + CD11b - F4/80 - та CD45 + CD11b + F4/80 +, ізольовані від SVF. Значення є середніми ± sem; n = 4. ( і ) Відсоток клітин, що експресують Mincle, у різних імунних клітинах у SVF. Значення є середніми для чотирьох зразків.

Повнорозмірне зображення

Змінений розподіл ліпідів у мишей Mincle KO

( до ) Маса тіла та жир та вага печінки Mincle KO та мишей дикого типу на 16 тижні. Значення є середніми ± сем. Дані аналізуються за допомогою дисперсійного аналізу (ANOVA) з подальшим тестом Тукі-Крамера. ## P # P ## P ¶ P

( до ) Ілюстрація TDM-стимульованих експериментів із використанням SVF. SVF, приготований з епідидимальної жирової тканини мишей ob/ob, стимулювали TDM протягом 3 днів. ( b ) Вплив стимуляції TDM на експресію мРНК Mincle, Tnfa, пов'язаних з фіброзом генів (Tgfb1, Pdgfb, Timp1) та Acta2. Значення є середніми ± сем. Дані аналізуються неспареним t-критерієм; n = 4, ** P-CD31 - у SVF, багатому фібробластами, приготовленому з епідидимальної жирової тканини мишей ob/ob за допомогою системи сортування магнітних клітин (MACS). Клітини стимулювали TDM протягом 7 днів. ( d ) Вплив стимуляції TDM на експресію мРНК Acta2 та Col1a1 (колаген I). Значення є середніми ± сем. Дані аналізуються неспареним t-критерієм; n = 4, ** P

На підставі наших спостережень ми висловили гіпотезу про роль Мінкеля у запаленні жирової тканини при ожирінні наступним чином (рис. 8). Під час розвитку ожиріння експресія Мінкле індукується головним чином за допомогою TLR4 в інфільтрованих макрофагах, як повідомлялося раніше 18. Активуючись ендогенним лігандом, що виділяється з відмираючих адипоцитів, Mincle бере участь у агрегації макрофагів, утворюючи CLS, де існує стійка взаємодія між адипоцитами та макрофагами. Активація мінкле також індукує експресію генів, пов'язаних з фіброзом, через Syk, що призводить до утворення міофібробластів, можливо, через міжклітинний зв'язок між макрофагами та фібробластами. Як результат, надмірне вироблення ЕКМ може обмежити гіпертрофію адипоцитів, спричинену ВЧР, що відіграє роль у накопиченні ліпідів у печінці та непереносимості глюкози.

Під час розвитку ожиріння експресія Мінкле індукується в інфільтрованих макрофагах і активується ендогенним лігандом, що виділяється з відмираючих адипоцитів. Мінкл бере участь в агрегації макрофагів, утворюючи CLS, а активація Мінкле також індукує експресію генів, пов'язаних з фіброзом, що призводить до утворення міофібробластів. Як результат, надмірна продукція ECM може обмежити гіпертрофію адипоцитів, спричинену ВЧР, що відіграє роль у накопиченні ліпідів у печінці та непереносимості глюкози.

Повнорозмірне зображення

Підводячи підсумок, у цьому дослідженні ми демонструємо, що Mincle відіграє вирішальну роль у формуванні CLS та фіброзі жирової тканини, спричинених HFD, що може зменшити здатність зберігання ліпідів у жировій тканині та посилити позаматкове накопичення ліпідів. Наші дані також припускають, що Mincle у макрофагах буде новою терапевтичною мішенню для запобігання або лікування спричиненого ожирінням запалення жирової тканини та порушення обміну речовин.

Методи

Реагенти

Всі реагенти були придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі) або Nacalai Tesque (Кіото, Японія), якщо не зазначено інше.

Тварини

Гістологічний аналіз

Гібридизація in situ

Гібридизацію in situ для мРНК Mincle проводили, як повідомлялося 42. Блоки тканини, вкладені в парафін, з жирової тканини епідидиму були розділені на 8 мкм. Зрізи фіксували 4% параформальдегідом протягом 15 хв, обробляли 8 мкг мл -1 протеїнази К протягом 30 хв при 37 ° C, повторно фіксували 4% параформальдегідом і потім ацетилировали 0,25% оцтовим ангідридом протягом 10 хв. Гібридизацію проводили зондами при концентраціях 300 нг мл −1 при 60 ° С протягом 16 год. Після гібридизації зрізи промивали 5 х сольовим розчином цитрату натрію (SSC) при 60 ° C протягом 20 хв, а потім 50% формамідом і 2 × SSC при 60 ° C протягом 20 хв з наступною обробкою 50 мкг мл -1 RNaseA протягом 30 хв при 37 ° C. Після того, як зрізи додатково кілька разів промивали 2 × SSC та 0,2 × SSC, їх інкубували з кон’югатом анти-DIG AP (Roche) протягом 1 години при кімнатній температурі. Після двічі промивання реакції забарвлення проводили з розчином NBT/BCIP (Roche) протягом ночі. Кілька зрізів подвійно фарбували маркером макрофагів Iba1.

Проточний цитометричний аналіз.

Проточний цитометричний аналіз SVF проводили, як описано 43, 44. Коротше кажучи, жирову тканину епідидиму збирали, розрізали на дрібні шматочки та інкубували протягом 20 хв у розчині колагенази (2 мг мл -1 колагенази типу 2 (Вортінгтон, Лейквуд, Нью-Джерсі)) з легким струшуванням. Після фільтрування через сітку 180 мкм ми центрифугували її та ресуспендували у солі, забуференному фосфатом (PBS). Ми двічі промивали дисоційований SVF PBS, інкубували їх протягом 10 хв в лізируючому еритроцитах буфері і фільтрували через сітку 70 мкм. Клітини сортували за допомогою FACSAriaII (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія) і використовували для аналізу експресії мРНК. Клітини, що експресують мінкл, аналізували за допомогою FACSCantoII (BD Biosciences) та FlowJo 7.2.2. програмне забезпечення (Tomy Digital Biology, Токіо, Японія). Клітини, що експресують мінкл, ідентифікували за допомогою антитіл до Мінкле (клон 4A9; MBL, Нагоя, Японія), мічених Lightning-Link Atto-488 (Innova Biosciences, Кембридж, Великобританія). Інші антитіла, що використовуються в проточному цитометричному аналізі, були перелічені в додатковій таблиці 3.

Конфокальний мікроскопічний аналіз

Для конфокального мікроскопічного аналізу ізольовані шматочки тканини фіксували у 4% формальдегіді та просочували 0,5% Triton X-100. Потім зразки блокували 1% BSA та інкубували з парою первинних антитіл, а потім з відповідними вторинними антитілами. Фарбування досліджували за допомогою конфокальної мікроскопічної системи FluoView FV10i (Olympus, Токіо, Японія).

Вміст колагену в жировій тканині

Загальний вміст колагену в жировій тканині вимірювали за допомогою комерційного набору (аналіз загального колагену QuickZyme; QuickZyme Biosciences, Лейден, Нідерланди).

Вміст тригліцеридів у печінці

Загальні ліпіди в печінці екстрагували із застосуванням крижаного хлороформу та метанолу, 2: 1 (об./Об.). Вміст тригліцеридів у вмісті печінки вимірювали за допомогою набору для ферментативного аналізу (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Японія).

Тести на толерантність до глюкози та інсуліну

Тест на толерантність до глюкози проводили після 18-годинного голодування. Концентрацію глюкози в крові вимірювали через 0, 15, 30, 60, 90 і 120 хв після внутрішньочеревної ін'єкції глюкози (2 г кг-1 маси тіла) за допомогою вимірювача глюкози в крові (Glutest PRO R; Sanwa-Kagaku, Нагоя, Японія ). Для тесту на толерантність до інсуліну інсулін (0,5 од. Кг -1 маси тіла Humulin R-інсуліну; Eli Lilly, штат Індіанаполіс, Індонезія) вводили внутрішньочеревно після 1-годинного голодування. Концентрацію глюкози в крові вимірювали через 0, 15, 30, 60, 90 та 120 хв після ін’єкції.

Вестерн-блот Akt

Вестерн-блот проводили, як описано 45. Коротше кажучи, мишам, які страждали від їжі протягом 16 год, ін’єктували інсулін (0,5 од. Кг -1 маси тіла Humulin R-інсуліну; Eli Lilly) або PBS через посткавальну вену. Печінку, м’яз підошви та епідидимальну жирову тканину видалили через 1, 2 та 3 хв після ін’єкції відповідно. Імуноблотинг проводили з використанням анти-фосфо-Akt (Thr308) антитіл (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) та анти-Akt антитіл (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Каліфорнія). Імуноблот-зображення кількісно визначали за допомогою ImageQuant LAS 4000 mini (Fujifilm, Токіо, Японія). Репрезентативні невирізані плями показані на додатковій фіг. 10.

Аналіз сироватки

Концентрації FFA та ALT у сироватці крові та концентрації інсуліну вимірювали за допомогою стандартного ферментативного аналізу або комерційно доступного набору імуноферментних аналізів.

TDM стимуляція

Для стимуляції перитонеальних макрофагів або SVF, спричинених тіогліколятом, з епідидимальної жирової тканини мишей ob/ob, TDM, розчинені в хлороформі в 1 мг мл -1, розбавляли в ізопропанолі і додавали на 12- або 48-лункові культуральні планшети (5 або 1,25 мкг TDM на лунку відповідно) з наступним випаровуванням розчинника, як описано 13, 46. У деяких експериментах перитонеальні макрофаги спільно культивували з фібробластами жирової тканини (CD45 - CD31 - клітини, приготовані з SVF мишей ob/ob за допомогою системи сортування магнітних клітин (MACS; Miltenyi Biotec, Auburn, CA)). Для експериментів in vivo емульсію, що містить TDM (10 мкг; посилання 13), вводили безпосередньо в жирову тканину епідидиму. Через три, п’ять та сім днів після ін’єкції жирову тканину епідидиму збирали і піддавали аналізу експресії генів та трихромних та імунофлуоресцентних фарбувань Массона.

Кількісна ПЛР у режимі реального часу

Кількісну ПЛР у реальному часі проводили, як описано 18. Коротше кажучи, загальну РНК екстрагували з тканин або культивованих клітин за допомогою реагенту Сепасол, а 10 нг кДНК використовували для ампліфікації ПЛР у реальному часі за протоколом виявлення SYBR GREEN у термоциклері (StepOne Plus, Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія) . Праймери, використані в цьому дослідженні, перелічені в додатковій таблиці 4. Дані були нормалізовані до рівнів 36B4 та проаналізовані за допомогою порівняльного методу КТ.

Аналіз мікрочипів

Аналіз мікрочипів проводили за допомогою масивів Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0 згідно з інструкціями виробника. Нормалізацію даних про експресію генів обробляли за допомогою алгоритмів Affymetrix Microarray Analysis Suite 5.0 (MAS5). Диференційовано експресовані гени були відібрані із зміною складки та значенням Р (зміна складки> 2, Р 39. Коротше кажучи, клітини кісткового мозку, отримані від мишей Mincle KO- Egfp Tg та мишей Egfp Tg, тричі промивали холодним PBS та вводили внутрішньовенно (1,8 × 10 6 клітин) у опромінених 8-тижневих мишей-реципієнтів дикого типу самців 7,5 Гр. Через 4 тижні швидкість заміщення клітин кісткового мозку визначали підрахунком EGFP-позитивних клітин у периферичній крові, а потім мишей годували до HFD протягом 16 тижнів.