реферат
Головний
Нині введено ряд потужних інгібіторів ароматази для використання у жінок в постменопаузі з гормонозалежними пухлинами молочної залози (Miller, 1999). Незважаючи на те, що їх розвиток являє собою значний прогрес у терапії, доступній для лікування жінок з раком молочної залози, показники повної та часткової відповіді при застосуванні в якості лікування другої лінії залишаються відносно низькими (10–20%) із часом до прогресування пухлини. відносно короткий (3-6 місяців) (Santen and Harvey, 1999). Однак у недавньому дослідженні з ад'ювантом використання інгібітора ароматази проти тамоксифену, як окремо, так і в комбінації, виживання без захворювань було значно довшим у пацієнтів, які отримували терапію інгібіторами ароматази (ATAC Trialist Group, 2002). Крім того, низка несприятливих побічних ефектів, включаючи проблеми з шлунково-кишковим трактом, запаморочення та нудоту, пов’язані із застосуванням деяких інгібіторів (Buzdar et al, 1997). Застосування інгібіторів ароматази у жінок у постменопаузі з раком молочної залози також мало несприятливий вплив на рівень ліпідів у сироватці крові (Elisaf et al, 2001). Тому існує потреба у розробці нових методів пригнічення активності ароматази, які можуть діяти конкретно в грудях, але повинні замінити інші естроген-чутливі тканини.
Фібробласти, отримані з нормальних або злоякісних тканин молочної залози, використовувались як модель для вивчення активності ароматази, оскільки ці клітини мають набагато вищий рівень активності, ніж епітеліальні клітини (Singh et al, 1999). За допомогою таких фібробластів було виявлено ряд цитокінів, включаючи інтерлейкін 6 (IL-6) та фактор некрозу пухлини (TNFα) як важливих регуляторів активності ароматази фібробластів (Reed et al., 1992; Macdiarmid et al., 1994). Активність периферичної ароматази підвищується у людей похилого та ожиріння (Grodin et al., 1973; Hemsell et al., 1974), а продукція IL-6 також збільшується в цих умовах (Wei et al., 1992; Mohamed-Ali et al., 1997),
Здатність IL-6 стимулювати активність ароматази в культивованих фібробластах значно посилюється (до 21 разів) завдяки його розчинному рецептору IL-6sR (Singh et al., 1995; Zhao et al., 1995a, 1995b). IL-6 продукується фібробластами, отриманими з нормальних і злоякісних тканин молочної залози, тоді як IL-6sR виявляли лише в кондиціонованому середовищі, отриманому із злоякісних фібробластів (Singh et al, 1995). Багато пухлин молочної залози просочуються макрофагами та лімфоцитами, і є дані, що ці клітини можуть бути основним джерелом факторів, здатних стимулювати активність ароматази в грудях (Purohit et al, 1995; Reed and Purohit, 1997).
Як і інші цитокіни, IL-6 діє, зв'язуючись з мембранним рецептором. Комплекс IL-6R складається з ліганд-зв'язуючої субодиниці з молекулярною вагою 80 кДа (gp80) і 130 кДа (gp130) білка передачі сигналу (Taga et al., 1989; Kishimoto et al., 1995). Субодиниця gp80, яка також може існувати у розчинній формі (Rose-John and Heinrich, 1994), пов'язує IL-6 з низькою спорідненістю і повинна асоціюватися з більшою gp130 для зв'язування з високою спорідненістю та передачі сигналу. Хоча моноклональні антитіла до IL-6 (Mabs) використовувались для скасування ефекту IL-6, вони ефективні лише частково (Klein et al, 1991). Mabs утворюють комплекс з IL-6, що призводить до зниження кліренсу цитокінів.
Як альтернативний спосіб блокувати дію IL-6, Ciliberto та його колеги розробили ряд антагоністів рецепторів IL-6, які були мутованими формами IL-6, які можуть зв'язуватися з IL-6R, але блокувати його в неактивній конфігурації ( Demartis та ін., 1996). Це гальмує його здатність взаємодіяти з білком передачі сигналу gp130. Варіант IL-6 Sant 7 визнано найпотужнішим суперантагоністом і зміг пригнічити стимульований IL-6 ріст декількох різних типів злоякісних клітин. Через важливу роль, яку IL-6 + IL-6sR відіграє в регуляції активності ароматази, було досліджено здатність Sant7 блокувати активовану цитокінами активність ароматази. Sant 7 також використовували для отримання подальшої інформації про процес, за допомогою якого PGE2 регулює активність ароматази в фібробластах, що походять від тканин молочної залози.
Матеріали і методи
Культура фібробластів
Зразки жирової тканини молочної залози брали у жінок, яким зробили редукційну мамопластику. Крім того, у жінок, які перенесли люмпектомію або мастектомію, брали проби на жирову тканину поблизу пухлин молочної залози (тобто «тканини, що не беруть участь») та пухлин молочної залози.
Резектовані тканини подрібнювали скальпелями та інкубували в модифікованому мінімальним ефірним середовищем EEMS (EMEM) протягом 18-24 годин при 37 ° C з колагеназою (200 мкг мл-1). Дисперговані клітини збирали центрифугуванням і двічі промивали середовищем для видалення колагенази. Розсіяні клітини висівали в колби з культурами площею 25 см 2 і давали можливість прикріпитися. Клітини вирощували до місця злиття в EMEM, що містить буфер HEPES (20 ммоль-1), 10% фетальної телячої сироватки (FCS) та добавки (Reed et al, 1992). Клітини регулярно пасирували два-три рази, потім засівали 25 см2 колбами для культивування та вирощували до 70-80% злиття. Середовище замінювали 2% с. У це середовище додавали дексаметазон (100 нМ) у присутності дексаметазону (100 нМ) протягом 48 годин і включали: IL-6 + IL-6sR (50 та 100 нг мл-1, дослідження та розробки). Systems Ltd, Абінгдон, Оксон, Великобританія) та PGE2 (10 мкМ, Sigma, Poole, Дорсет, Великобританія).
Сант 7
Суперантагоніст IL-6R Sant 7 був отриманий від Sigma-Tau (Рим, Італія) і синтезований, як описано вище (Salvati et al., 1995). Сант 7 розчиняли в живильному середовищі перед додаванням до клітин.
Тест на ароматазу
Активність ароматази вимірювали в інтактних моношарах фібробластів, використовуючи (1β - 3H) андростендіон (15-30 Ci ммоль - 1, NEN - Du Pont, Stevenage, Herts, Великобританія) протягом 3 - 20 годин (Reed et al, 1992). Коротко кажучи, моношари фібробластів промивали один раз збалансованим фізіологічним розчином Ерла ЕМ (2,5 мл), якщо не зазначено інше. 3H андростендіону (0,25 мкКі) додавали до кожної колби, щоб отримати кінцеву концентрацію субстрату від 3 до 4 нМ. Моношари фібробластів інкубували із субстратом протягом 3 - 20 годин при 37 ° C залежно від активності базальної ароматази в клітинах. Колби, що не містять клітин, також інкубували із субстратом та безсироватковим середовищем у вигляді заготовок. Після інкубації аликвоту середовища (2 мл) видаляли з кожної колби і аликвоти двічі екстрагували діетиловим ефіром (5 мл), який відкидали. Залишилася водна фаза оброблялася рівним об'ємом розчину, що містить активоване вугілля (5,0%) і декстран (0,5%), центрифугувалась і аліквота надосадової рідини (1 мл) бралася для визначення його радіоактивного вмісту за допомогою рідинної сцинтиляційної спектрометрії. На сьогоднішній день виявлено, що активність ароматази, виміряна у фібробластах, є лінійною щодо часу до 24 годин (Macdiarmid et al., 1994).
статистика
Значимість відмінностей в активності ароматази в оброблених та контрольних клітинах оцінювали за допомогою t-критерію Стьюдента. Репрезентативні приклади результатів наводяться для експериментів, які повторювались 2-3 рази.
результат
Здатність Sant7 інгібувати активовану цитокінами активність ароматази спочатку досліджували у фібробластах, отриманих із жирової тканини молочної залози суб'єкта, який проходить редукційну мамопластику (рис. 1). У цих фібробластах лише IL-6 (при 50 нг мл-1) підвищував активність ароматази на 27%. Однак додавання IL-6sR у поєднанні з IL-6 суттєво посилювало його здатність стимулювати активність ароматази (у 7,7 рази порівняно з контролем). Сант 7 спричинений значним (Р 1 (Рисунок 3).
Вплив суперантагоніста рецептора IL-6, Sant7 на активовану активністю ароматази, стимульовану IL-6, IL-6sR або IL-6 + IL-6sR, у фібробластах, отриманих від зменшення жирової тканини мамопластики. Фібробласти культивували у 2% очищеному FCS, EMEM без фенольно-червоного і додавали в це середовище протягом 48 годин у присутності дексаметазону (100 нМ). Активність ароматази вимірювали в інтактних моношарах фібробластів з використанням [3H-ip] андростендіону в якості субстрату. Значимість відмінностей у оброблених та контрольних клітинах оцінювали за допомогою t-критерію Стьюдента (a, P
( A ) Вплив Sant7 на активність ароматази, стимульовану IL-6, IL-6sR або IL-6 + IL-6sR, у фібробластах, отриманих із тканини, розташованої ближче до пухлини молочної залози. Фібробласти культивували у 2% очищеному FCS, EMEM без фенольно-червоного, і додавали в це середовище протягом 48 годин у присутності дексаметазону (100 нМ). Активність ароматази вимірювали в інтактних моношарах, використовуючи [3H-1β] андростендіон в якості субстрату. Один набір клітин (попередня обробка) попередньо інкубували з Sant 7 протягом 3 годин перед додаванням IL-6 + IL-6sR, тоді як для іншого набору (без попередньої обробки) Sant 7 додавали одночасно з IL-6 + IL -6. 6sR (a, P
Відповідь дози на здатність Sant7 інгібувати стимульовану IL-6 + IL-6sR ароматазу у фібробластах, отриманих із тканини, розташованої ближче до пухлини молочної залози. Sant 7 пригнічував стимульовану активність ароматази з IC 50 60 нг мл-1 (тобто три вимірювання, при яких коефіцієнти варіації
Здатність Sant7 інгібувати IL-6 + IL-6 sR стимуляцію активності ароматази у фібробластах, отриманих з мамопластичної відновлювальної тканини. Клітини обробляли протягом 48 годин IL-6 (50 нг мл-1), IL-6sR (100 нг мл-1) або Sant7 (10 мкг мл-1) або в комбінаціях, як показано, за відсутності або присутності дексаметазону (Dex, 100 нМ). Активність ароматази в контрольних клітинах становила 1370 ± 15 фмоль 20 год -1 106 клітин -1 і 639 ± 35 фмоль 20 год -106 клітин -1, для фібробластів, культивованих у відсутність або присутність дексаметазону (середнє значення ± sd, n = 3) P
( A ) Вплив Sant 7 на PGE2-стимульовану ароматазу в проксимальних фібробластах. IL-6 (50 нг мл-1) + IL-6sR (100 нг мл-1) стимулювали активність ароматази більшою мірою, ніж PGE2 (10 мкМ). Sant7, який блокує стимульовану IL-6 + IL-6sR активність ароматази, значно знижує здатність PEG2 стимулювати активність ароматази в цих фібробластах. Щоб визначити, чи наслідки Sant 7 були оборотними (Rev), один набір фібробластів (IL-6 + IL-6sR (Rev)) попередньо інкубували з Sant 7 протягом 12 годин, а потім Sant 7 видаляли промиванням клітин фосфатом . - забуференний сольовий розчин. IL-6 + IL-6sR стимулювали активність ароматази в цих клітинах після промивання в аналогічному діапазоні фібробластів, які не зазнавали впливу Sant 7, що вказує на те, що Sant 7 не діє безповоротно. (а, с