предметів

Ця стаття оновлена

реферат

Передумови:

МікроРНК (miРНК) є ключовими регуляторами експресії генів. У цьому дослідженні ми дослідили, чи змінена експресія мікроРНК відіграє важливу роль у визначенні фенотипу запального раку молочної залози (IBC).

методи:

Ми використовували кількісну технологію ПЛР для оцінки експресії 384 міРНК у 20 IBC та 50 зразках, що не є IBC. Щоб зрозуміти біологічні функції, нерегульовані аномалією експресії мікроРНК, ми шукали прямі мішені міРНК, виконуючи аналіз парного коефіцієнта кореляції на рівні експресії 10,962 месенджерської РНК (мРНК) і порівнюючи ці результати з прогнозованими цілями мікроРНК від TargetScan5. 1.

результати:

Ми виявили 13 мікроРНК, рівні експресії яких змогли правильно передбачити природу аналізованої проби (IBC проти не IBC). Для цих міРНК ми виявили загалом 17 295 корельованих пар міРНК-мРНК, з яких 7012 та 10 283 пари показали негативні та позитивні кореляції. Для чотирьох miРНК (miR-29a, miR-30b, miR-342-3p та miR-520a-5p) корельовані гени відповідали запланованим цілям. Аналіз збагачення генів на цих генах показав значне збагачення в біологічних процесах, пов'язаних з проліферацією клітин і передачею сигналів.

висновок:

Наскільки нам відомо, це дослідження являє собою перший інтегрований аналіз мікроРНК та експресії мРНК у IBC. Ми ідентифікували набір з 13 міРНК, експресія яких відрізнялася між IBC та не IBC, роблячи ці мікроРНК кандидатними маркерами для підтипу IBC.

Головний

МікроРНК (miРНК) - це клас некодуючих РНК, здатних регулювати експресію генів на посттранскрипційному рівні шляхом зв'язування з 3'-нетранслируемой областю цільової РНК-медіатора (мРНК) через часткову послідовність гомології та викликаючи трансляційну блокаду. та/або деградація мРНК (He and Hannon, 2004). На момент написання статті було описано 721 ген генів міРНК (//microrna.sanger.ac.uk/sequences), і за підрахунками кожна з міРНК націлена приблизно на 100 різних молекул мРНК (Brennecke et al, 2005; Lewis et al., 2005, Lim et al., 2005). МіРНК відіграють важливу роль у основних процесах, таких як диференціація, ріст клітин, реакція на стрес та загибель клітин (Miska, 2005; Zamore and Haley, 2005). Як результат, змінена експресія міРНК, ймовірно, сприятиме захворюванням людини, включаючи рак. Насправді спектр мікроРНК, експресованих у твердих ракових пухлинах, сильно відрізняється від спектру нормальних клітин, і передбачувані мішені для диференційовано виражених мікроРНК значно збагачені для білкових супресорів та кодуючих білок онкогенів (Lu et al, 2005; Volinia et al, 2005). 2006).

Вони зосереджені на раку молочної залози, конкретні рівні міРНК варіюються між злоякісними та нормальними тканинами молочної залози, і вони можуть класифікувати пухлини за клініко-патологічними змінними, такими як індекс проліферації, рецептори стероїдних гормонів та статус Her2/neu, вузловий статус та стадія пухлини (Iorio et al., 2005; Mattie et al., 2006; Lowery et al., 2008). Крім того, мікроРНК різним чином експресуються між молекулярними підтипами раку молочної залози, включаючи просвіт А, просвіт В, базал та Her2 + (Blenkiron et al, 2007). Це вказує на потенціал підписів miRNA як нових прогностичних показників, які можуть сприяти поліпшенню відбору пацієнтів для ад'ювантної терапії. Фоекенс та ін. (2008) нещодавно пов’язали чотири мікроРНК (miR-7, miR-128a, miR-210 та miR-516-3p) з більш коротким часом із віддаленими метастазами в рецепторі естрогену (ER), у лімфатичних вузлах. негативний рак молочної залози.

Матеріали і методи

Зразки пацієнтів

Зразки пухлини були отримані з банку тканин загальної лікарні Сінт-Августін (Антверпен, Бельгія). Клінічні та патологічні дані зберігаються у базі даних відповідно до політики конфіденційності лікарні. Зразки передавали патологоанатомам відразу після резекції, а частину тканини поміщали в рідкий азот, а потім зберігали при -180 ° C. До цього дослідження було включено 20 пацієнтів з IBC та 50 пацієнтів, що не є IBC. Запальний рак молочної залози діагностували згідно з критеріями в системі постановки AJCC (Американський об’єднаний комітет з питань раку) -TNM (Singletary et al, 2002). У всіх пацієнток з IBC спостерігалося дифузне збільшення ураженого раптового початку молочної залози. Повідомлялося про еритему та набряк шкіри, які охоплювали більше третини грудей. Наявність шкірної лімфатичної інвазії як ізольованого спостереження було недостатньо для діагностики МКБ і не було необхідним для діагностики. Контрольну групу не-IBC порівнювали за гістологією пухлини, експресією ER та ампліфікацією епідермального фактора росту людини (HER2) людини, але не для стадії пухлини, щоб визначити справжні детермінанти IBC. Характеристики пухлини наведені в таблиці 1.

Стіл в натуральну величину

Повне виділення РНК, комплементарний синтез ДНК та кількісне визначення мікроРНК

Статистика та біоінформатика

Щоб зменшити технічні зміни, всі мікроРНК з межею виявлення С (пороговий цикл) менше 35 циклів ПЛР принаймні в 25% зразків були відфільтровані, в результаті чого з’явився список з 322 інформативних мікроРНК. Далі ми виконали нормалізацію між зразками шляхом середнього центрування розподілу рівнів експресії міРНК для кожного зразка (Mestdagh et al, 2009). Відносний рівень експресії міРНК розраховували за методом Att (Livak and Schmittgen, 2001).

Для ідентифікації закономірностей експресії miRNA ми виконали ієрархічний повний без нагляду кластерний аналіз з використанням евклідової відстані як метрики невідповідності. Кількість надійних кластерів вибірки визначали за алгоритмом силуету. Подальше ми досліджували зв'язок результатів кластеризації зразків з клініко-патологічними змінними, використовуючи тест Пірсона та глобальний тест Гоемана (Goeman et al, 2004).

Для ідентифікації окремих мікроРНК, асоційованих з IBC, ми спочатку відібрали всі мікроРНК, які були значно надмірно вираженими або недоекспресованими в IBC, порівняно з не IBC, використовуючи непараметричний аналіз. Потім кожну з цих мікроРНК піддавали багатовимірному регресійному аналізу з N станом, станом M, стадією пухлини та ампліфікацією HER2 як коваріати. Таким чином, ми могли б ідентифікувати мікроРНК, які специфічно асоціюються з IBC, а не різницю в клініко-патологічних змінних між IBC та не IBC, які також, як відомо, впливають на експресію мікроРНК при раку молочної залози.

Щоб вивчити біологічну значимість виявлених мікроРНК, ми прийняли стратегію, нещодавно описану Wang et al (2009). По-перше, для кожної з міРНК, які були незалежно пов'язані з IBC, ми визначили набір передбачуваних генів-мішеней за допомогою кореляційного аналізу Спірмена, беручи до уваги як позитивні, так і негативні кореляції. Цей аналіз був проведений на підгрупі з 44 зразків (20 IBC та 24 зразки, що не є IBC), для яких були доступні профілі експресії генів Affymetrix HGU133 плюс 2,0 (Van Laere et al, 2007). Щоб визначити справжні цілі miRNA, ми порівняли списки передбачуваних цілей miRNA зі списками цілей miRNA, визначених TargetScan5.1 (//www.targetscan.org), використовуючи аналіз збагачення наборів генів гіпергеометричних генів. Ці мікроРНК, для яких цільові мікроРНК, визначені TargetScan5.1, були значно збагачені для кореляції визначених цільових мікроРНК, були піддані подальшому аналізу. Крім того, всі інші аналізи проводили лише на загальних генах між двома наборами мішеней мікроРНК. Ці гени аналізували для збагачених категорій онтології генів (GO) та Кіотської енциклопедії генів та геномів (KEGG) шляхом аналізу збагачення набору генів гіпергеометричних генів.

Щоб перевірити, чи виявлені мікроРНК є прогностично значущими, ми завантажили шість наборів даних про експресію генів з веб-сайту Національного центру біотехнологій (GSE7390, GSE9195, GSE1456, GSE11121, GSE2034 та GSE4922; //www.ncbi.nlm.nih), які є загальнодоступними. уряд). Крім того, набір даних, описаний ван де Вейвером та співавт. (2002) було отримано з веб-сайту Розетти (http://www.rii.com). Загалом ми проаналізували дані експресії мРНК із 1504 зразків раку молочної залози. Для кожної вибірки ми розрахували бали, пропорційні рівню експресії обраної мікроРНК, віднімаючи середнє значення негативно корельованих цільових мікроРНК із середнього значення позитивно корельованих цільових мікроРНК. Ці результати були стандартизовані (медіана = 0 і sd = 1), щоб забезпечити порівняння між різними наборами даних, та проаналізовані за допомогою моделі пропорційних небезпек Кокса як в одновимірних, так і в багатовимірних параметрах. Отриманою змінною було виживання при віддалених метастазах (DMFS, N = 1059), загальне виживання (OS, N = 652) або виживання без рецидивів (RFS, N = 1145), якщо це можливо.

Нарешті, у підгрупі з 44 зразків, для яких були доступні профілі експресії генів Affymetrix HGU133 плюс 2,0, ми порівняли експресію генів, що обробляють miRNA, між IBC та не IBC. Далі ми проаналізували передбачуваний регуляторний ефект усіх мікроРНК із бази даних TargetScan5.1 на профілі експресії генів із цих 44 зразків. Ми застосували підхід, нещодавно опублікований Cheng et al. (2009) для розрахунку оцінки регуляторного ефекту (RE) шляхом віднімання середнього положення мішеней miRNA від середнього значення цілей non-miRNA, з високими значеннями RE, що свідчать про сильний ефект. miRNA для експресії цілі і навпаки. Однак, оскільки цей показник враховує лише негативно регульовані мішені міРНК, ми скоригували оцінку RE таким чином, що враховувались як гальмівні, так і активізуючі ефекти. Потім ці оцінки RE порівнювали між IBC та не IBC, використовуючи непараметричний тест.

Всі аналізи даних проводились із використанням біопровідника у R (//www.bioconductor.org). Корекцію для багаторазового тестування проводили за допомогою процедури Бенджаміна та Хохберга для збільшення частоти помилково позитивних результатів, а скориговані значення P 2 показали, що кластеризація зразків була пов'язана з експресією ER (P = 0,011), гістологічним ступенем пухлини (P = 0,004)., Стан N (P = 0,014) та стадія пухлини (P = 0,010). Не було виявлено жодних зв'язків із кластеризацією зразків щодо статусу Т і М, ампліфікації HER2 або підтипу пухлини (IBC або non-IBC).

легкої

Ієрархічне групування 20 IBC та 50 зразків, що не належать до IBC, відповідно до моделі експресії 50 різних міРНК. Значення виразу для цих 50 міРНК представлені у матричному форматі, рядки вказують міРНК, а стовпчики вказують зразки. Високі значення виразу пофарбовані червоним кольором, а низькі значення виразів - синім. Виявлено три надійні кластери зразків, які суттєво асоціювались із експресією ЕР та гістологічною оцінкою. Зокрема, поєднані перші два (синій та жовтий) кластери зразків збагатили на ER + пухлини молочної залози (80% зразків) порівняно з третім (червоним) скупченням зразків (50% зразків) (P χ 2 = 0, 028), особливо у першому У (блакитному) кластері вибірки 20% зразків були погано диференційовані порівняно з 60% зразків у другому (жовтому) кластері вибірки (Р 2 = 0,004), що вказує на поділ ER + пухлини молочної залози на просвіт А та просвіт В. Жодної асоціації кластеризації зразків не спостерігалося з різницею між IBC та не IBC: 30, 25 та 45% зразків IBC, згрупованих у перший (синій), другий (жовтий) та третій (червоний) кластери вибірки (P = 2 = 0,082). (Кольорове відтворення цього зображення доступне в повній HTML-версії рукопису.)

Повнорозмірне зображення

Глобальний аналіз Goeman був проведений для визначення зв'язків експресії мікроРНК з різними клініко-патологічними факторами (табл. 2) для зменшеного набору даних, що складається з 50 різних мікроРНК. Суттєві асоціації спостерігалися щодо експресії ER та гістологічного ступеня пухлини, але не для статусу T, N або M, стадії пухлини, ампліфікації HER2 або підтипу пухлини (IBC або non-IBC). Таким чином, найбільша різниця у експресії мікроРНК у наборі зразків раку молочної залози була пов’язана з різницею у експресії рецепторів стероїдних гормонів та гістології пухлини, а не різницею між IBC та не IBC. Насправді загальний розподіл значень експресії мікроРНК у IBC та не-IBC виглядає дуже подібним (Рисунок 2).

Стіл в натуральну величину

Розподіл значень експресії мікроРНК у ( A ) запальні пухлини молочної залози та ( B ) незапальних пухлин молочної залози.

Повнорозмірне зображення

Асоціація окремих мікроРНК із запальним раком молочної залози

Логістичний регресійний аналіз проводили для виявлення відмінностей у рівнях експресії міРНК між IBC та зразками, що не є IBC (таблиця 3). Було помічено, що небагато мікроРНК незалежно пов'язані з різницею між IBC та не IBC. Підвищена експресія miR-335, miR-337-5p, miR-451, miR-486-3p, miR-520a-5p та miR-548d-5p спостерігалася у підтипу IBC, тоді як miR-15a, miR-24, miR -29a, miR-30b, miR-320, miR-342-5p та miR-432-3p були суттєво знижені в порівнянні з не-IBC.

Стіл в натуральну величину

Подібний аналіз був проведений для виявлення відмінностей у експресії мікроРНК між зразками за Т станом (низький проти високого), N станом (позитивний проти негативного), M станом, стадією пухлини (низький проти високого), ступенем пухлини (високий проти низького), ER експресія та посилення HER2. Асоціації міРНК з цими клінікопатологічними факторами також наведені в таблиці 3.

Прогнозування мішеней міРНК та їх участь у біологічних процесах

Далі ми досліджували участь генів-мішеней miRNA у різних біологічних процесах, що може свідчити про функцію miRNA, прийнявши стратегію, нещодавно описану Wang et al (2009). Спочатку ми провели аналіз коефіцієнта кореляції для оцінки потенційних кореляційних зв'язків між рівнями експресії 13 ІРС-асоційованих miРНК (miR-335, miR-337-5p, miR-451, miR-486-3p, miR-520a-5p, miR -548d -5p, miR-15a, miR-24, miR-29a, miR-30b, miR-320, miR-342-5p та miR-342-3p) та рівні експресії мРНК 10 961 відомих генів у зменшеному пулі 44 раку зразки молочної залози, з яких 20 були IBC і 24 не IBC. Використання помилкової міри відкриття

Аналіз Каплана-Мейєра на виживання експресії цільового гена miR-520a-5p при віддаленому метастатичному раку молочної залози ( A a C. ) та загальна виживаність ( B a D ) як результат. Криві Каплана-Мейєра наведені для наборів даних ван де Вейвера та ін (2002) ( A a B ) та Desmedta et al (2007) ( C. a D ).

Повнорозмірне зображення

Стіл в натуральну величину

Експресія генів, що обробляють міРНК, при раку молочної залози

Оскільки IBC вважається моделлю агресивності раку молочної залози, нас цікавило визначення, чи асоційовані IBC miRNAs асоціюються з нейтральним прогнозом у пацієнтів без IBC. Через обмежену кількість наших клінічних зразків ми застосували непрямий підхід і співвідносили експресію цільового гена miRNA з результатами пацієнтів, використовуючи загальнодоступну інформацію з досліджень мікрочипів, яку можна було б отримати з бази даних експресії генів. Цей аналіз продемонстрував сильну асоціацію експресії цільового гена miR-520a-5p з більш короткими DMFS, RFS або OS у більшості досліджуваних наборів раку молочної залози. Цей результат демонструє можливу роль miR-520a-5p як прогностичного фактора при раку молочної залози. Визнаючи обмеження використання непрямого підходу, ці типи аналізів можуть допомогти в подальших масштабних дослідженнях прогностичного значення мікроРНК при раку молочної залози.

На закінчення, це дослідження, наскільки нам відомо, являє собою перший інтегрований аналіз експресії міРНК та мРНК у IBC. Ми виявили кількість міРНК, які різницево виражаються між IBC та не IBC. Далі ми повідомляли про змінену експресію генів, що обробляють miRNA, у IBC порівняно з не IBC. У випадку з чотирма пов'язаними з IBC мікроРНК ми змогли виявити різні біологічні процеси, які можуть вказувати на функцію цих мікроРНК та вказувати на їх потенційну зв'язок із прогнозом раку молочної залози на основі рівнів експресії їх генів-мішеней.