жирової

  • Предмети
  • Резюме
  • Мета:
  • Результати:
  • Завершення:
  • Вступ
  • Матеріали і методи
  • Підготовка кефіру
  • Дизайн і дослідження тварин.
  • Будова тіла
  • Витрата енергії
  • Визначення біохімічних маркерів.
  • Олійно-червона пляма O
  • Фарбування гематоксиліном та еозином
  • Імуногістохімічне фарбування
  • Зворотна транскриптаза в реальному часі (RT) -PCR
  • Вестерн-блот-аналіз
  • статистичний аналіз
  • Результати
  • Вплив кефіру на дієтичне споживання, масу тіла, масу печінки, базальний обмін речовин та енергетичні витрати
  • Вплив кефіру на склад тіла
  • Вплив кефіру на гепатомегалію та пошкодження печінки
  • Вплив кефіру на ТГ і ТК
  • Вплив кефіру на біохімічні показники сироватки крові, пов’язані з функцією печінки
  • Вплив лікування кефіром на експресію генів, що беруть участь у окисленні ліпідів та ліпогенезі
  • Кефір пригнічує ліпогенез
  • Обговорення
  • Додаткова інформація
  • Файли зображень
  • Додаткова фігура 1
  • Документи Word
  • Додаткова таблиця 1
  • Додаткова таблиця 2
  • Додаткова легенда фігури

Предмети

  • Обмін речовин
  • Безалкогольна жирова хвороба печінки
  • Ожиріння

Резюме

Мета:

Жирова хвороба печінки зазвичай асоціюється з ожирінням, резистентністю до інсуліну та діабетом. Важка жирова печінка іноді супроводжується стеатогепатитом і може призвести до розвитку гепатоцелюлярної карциноми. В даний час не існує ефективного лікування неалкогольної жирової хвороби печінки (НАЖХП); тому останні дослідження зосереджувались на розробці ефективних методів лікування цього стану. Це дослідження мало на меті оцінити вплив кефіру на метаболізм ліпідів печінки у об/об мишей, які зазвичай використовуються для моделювання жирової хвороби печінки.

Результати:

Кефір, який бере свій початок з Кавказьких гір, є слабоалкогольним, кислим ряжанкою. 5 Цей напій традиційно виробляють шляхом посіву молока на кефірне зерно. Кефір клінічно застосовується для лікування шлунково-кишкових захворювань, гіпертонії, ішемічної хвороби серця та алергії. 5, 6 Кілька досліджень продемонстрували численні біологічні дії кефіру, включаючи антибактеріальну, протигрибкову, антиоксидантну, протидіабетичну, протипухлинну та імуностимулюючу дію. Вуйчич та співавт. 7 показало, що споживання кефіру знижує рівень холестерину в сироватці крові у людини.

У цьому дослідженні ми досліджували, чи покращувало лікування кефіром симптоми синдрому жирової печінки у мишей з неактивними генами лептину (ob/ob). Експресія кількох генів, що кодують білки, що беруть участь у шляху ліпогенезу, включаючи регулюючий елемент стеролу білок 1 (SREBP1), синтазу жирних кислот (FAS) та карбоксилазу ацетил-КоА (ACC), а також окислювальний ліпідний шлях, включаючи Після обробки кефіром вимірювали рецептор, активований проліфератором пероксисоми α (PPARα) та карнітин печінкової пальмітоїлтрансферази-1α (CPT1α). Метою цього дослідження було зрозуміти ефективність та механізм впливу кефіру на синдром жирової печінки для сприяння його використанню в модуляції або лікуванні НАЖХП.

Матеріали і методи

Підготовка кефіру

Зерна кефірної закваски інокулювали (5%, мас./Об.) І розмножували в стерилізованому молоці при 20 ° C протягом 20 год для їх активації. Зерна відновлювали через сито, відновлювали (10%, мас./Об.) У стерилізованому свіжому молоці та інкубували при 20 ° C протягом 20 год. 8 Після фільтрування зерен ферментовані продукти ліофілізували у вигляді кефірного порошку з використанням ліофілізатора (VirTis, Warminster, PA, США).

Дизайн і дослідження тварин.

Будова тіла

Склад тіла цілої тварини оцінювали за допомогою мініспектрального аналізатора складу тіла всього миша (LF50) на основі TD-NMR (Bruker Optik, Ettlingen, Німеччина). Цей метод забезпечує точне вимірювання жиру, жиру, вільної рідини та води у живих мишей.

Витрата енергії

Система TSE LabMaster-3930 (Бад-Хомбург, Німеччина), що використовується для непрямої калориметрії, проводила кількісні комп’ютеризовані вимірювання швидкості базального метаболізму та енергетичних витрат. Для розрахунку споживання кисню (VO 2), виробництва вуглекислого газу (VCO 2) та коефіцієнта дихання (відношення VCO 2 до VO 2), контролювали концентрацію газу на вході та виході з герметичних камер. Базальний (легкий цикл для тварин, що голодують) та загальний рівень метаболізму (48 безперервних годин для вільно годуваних тварин) були розраховані на основі споживання O 2 та виробництва CO 2. Епізоди годування контролювали з точними вагами та постійно реєстрували для розрахунку споживання їжі.

Визначення біохімічних маркерів.

Рівні GOT, GPT, TC і TC у сироватці крові та печінці вимірювали колориметрично за допомогою автоматизованого аналізатора (аналізатор Beckman-Coulter Synchron LX20; Beckman, Fullerton, CA, USA). 13

Олійно-червона пляма O

Заморожені зрізи печінки (5–7 мкм) фарбували маслом Червоного O протягом 20–30 хв, промивали та фарбували гематоксиліном протягом 5 хв для визначення накопичення ліпідів у печінці. Репрезентативні мікрофотографії були зроблені зі збільшенням × 400 за допомогою камери, встановленої на мікроскопі.

Фарбування гематоксиліном та еозином

Тканину печінки фіксували у 10% забуференному формальдегіді та досліджували за допомогою фарбування гематоксиліном та еозином, як описано вище. 14, 15, 16

Імуногістохімічне фарбування

Зрізи, закріплені формальдегідом та вкладеним парафіном, вирізали до товщини 5 мкм, розділили та регідратували через градієнт спиртів у воді, а потім обробили окропом протягом 15 хвилин. Зрізи інкубували у 3% перекису водню протягом 10 хвилин, щоб блокувати активність ендогенної пероксидази, а потім інкубували протягом ночі при 4 ° C з первинними моноклональними антитілами кролика проти SREBP-1 та АСС. Для отримання антигену зрізи імунофарбували за допомогою набору VECTASTAIN ABC (Vector Laboratories Inc., Бурлінгейм, Каліфорнія, США), дотримуючись специфікацій виробника. Діамінобензидин використовували для розвитку фарбування, а зрізи фарбували гематоксиліном. 17, 18 Негативний контроль полягав у заміні нормальної сироватки крові первинним антитілом.

Зворотна транскриптаза в реальному часі (RT) -PCR

Загальну РНК екстрагували з тканини печінки за допомогою реагенту Trizol (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США), як зазначено виробником. Два мікрограми (2 мкг) загальної РНК ресуспендували в 9 мкл води, обробленої діетилпірокарбонатом; перший ланцюг комплементарної ДНК був синтезований за допомогою випадкових праймерів та ImProm-II RT (Promega, Madison, WI, USA) у загальному обсязі 20 мкл. Реакцію проводили при 42 ° С протягом 1 години. Для подальшої ампліфікації ПЛР аликвоту (1:10) продукту RT регулювали так, щоб містити 0,1 мкг кожного праймера, і додатковий буфер додавали до загального обсягу 20 мкл. RT-PCR у реальному часі проводили за допомогою SYBR Green (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) на аналізаторі Rotor-Gene 6000 (Qiagen, Germantown, MD, USA). 19 Для оцінки експресії генів проводили RT-PCR у реальному часі з п’ятьма генами (PPARα, CPT1α, SREBP1, ACC та FAS) з використанням комплементарної ДНК із тканини печінки. В якості внутрішнього контролю використовували комплементарну ДНК β-актину.

Вестерн-блот-аналіз

Експресію білка тканини печінки вимірювали вестерн-блот. Тканини печінки гомогенізували в 500 мкл буфера RIPA (5 мМ трис-HCl, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 1% NP40, 0,25% дезоксихолату натрію, 5 мМ ЕДТА та 1 м М етиленгліколь-біс (2-аміноетил-ефір ) -N, N, N, N -тетраоцтова кислота). Гомогенати центрифугували при 12000 g протягом 30 хвилин при 4 ° C. Потім білок (40 мкг) відокремлювали на 10% електрофорезі в поліакриламідному гелі додецилсульфату натрію та електроблотували на мембрани полівінілідендифториду. Мембрани інкубували в блокуючому розчині (5% бичачого сироваткового альбуміну) при кімнатній температурі протягом 2 годин, а потім інкубували з первинним антитілом (SREBP-1, ACC або β-актином) протягом ночі при 4 ° C. Після промивання мембрани інкубували з козячим анти-кролячим імуноглобуліном G-пероксидазою, кон'югованим вторинним антитілом. Мембрани були розроблені з використанням вдосконаленої системи виявлення хемілюмінесцентних вестерн-блот, як описано вище. двадцять

статистичний аналіз

Експериментальні значення виражаються як середнє значення ± se. Всі дані аналізували за допомогою t-критерію. Статистично значущі результати представлені як P # або †) або P ## або ††).

Результати

Вплив кефіру на дієтичне споживання, масу тіла, масу печінки, базальний обмін речовин та енергетичні витрати

Миші з дефіцитом лептину (ob/ob), які отримували кефір 140 мг кг –1 BW, набирали меншу вагу в дні 20–27 та важили значно менше, ніж миші групи ob/ob + Mock (Р – 1 BW кефіру показали 39 % збільшення швидкості метаболізму порівняно з групою ob/ob + Sham (P –1 BW кефіру суттєво збільшив загальні добові витрати енергії порівняно з ob/ob + групою Mock (P –1 Kefir BW збільшив базальну швидкість метаболізму та загальну добу витрата енергії і, таким чином, зменшення приросту ЧВ.

Ефекти кефіру BW ( до ), щоденне споживання ( b ), базальний рівень метаболізму ( c ) та загальні добові витрати енергії ( d ) від мишей ob/ob та WT. Дані були виражені як середнє значення ± se * P –1 БВ кефіру показали значно нижчий вміст жиру та вищий вміст сухої та загальної води, ніж у мишей у необробленій групі ob/ob + Mock (Р –1 BW кефіру, знижена гепатомегалія та жирне та жирне формування печінки (малюнки 2b, f та j) у цих тварин. Фарбування гематоксиліном та еозином та олійно-червоне фарбування O печінки виявляло скупчення крапель ліпідів у печінці мишей ob /., оброблених групою Mock (малюнки 3a, e і i), тоді як краплі ліпідів (макровезикулярний жир) були рідкісними у печінці оброблених кефіром мишей ob/ob (малюнки 3b, f та j). Однак миші, які отримували WT (малюнки 3d, h та l) або не (малюнки 3c, g та k) отриманий кефір не накопичував крапель ліпідів у печінці, як аналізували гістопатологи. Ці результати вказують на те, що обробка мишей ob/ob протягом 4 тижнів 140 мг кг –1 БВ кефіру знижувала макровезикулярне накопичення жиру в печінці та утворення жирових тканин.

Вплив кефіру на зовнішню сторону печінки, ліву частку печінки та жирову тканину мишей ob/ob та WT. ( до ), ( і ) Y ( i ): ob/ob + імітаційна група як модель жирної печінки миші; ( b ), ( F ) Y ( j ): група ob/ob + кефір як група жирних печінкових мишей; ( c ), ( g ) Y ( k ): WT + Mock group як звичайне управління мишею; ( d ), ( h ) Y ( л ): Група WT + кефір як група лікуваних нормальних мишей. ( до - d ) Показати зовнішні види печінки миші з чотирьох різних груп. ( і - h ) Показати ліві частки печінки мишей у чотирьох різних групах. ( i - л ) Показує зовнішні види жирової тканини мишей у чотирьох різних групах. Шкала шкали = 1 см.

Повнорозмірне зображення

Вплив кефіру на фарбування гематоксиліном та еозином (H&E) та фарбування олійно-червоним O гістологічно розділеної печінки та жирової тканини на мишах ob/ob та WT. ( до ), ( і ), ( i ) Y ( м ): ob/ob + змодельована група; ( b ), ( F ), ( j ) Y ( n ): ob/ob + кефірна група; ( c ), ( g ), ( k ) Y ( або ): WT + Групова група; ( d ), ( h ), ( л ) Y ( стор ): WT + група кефіру. ( до - d ) Зображення збільшено до × 200 або до ( і - л ) 400X. ( до - h ) Фарбування H&E та ( i - л ) Масляно-червоне O фарбування гістологічних відділів печінки. ( м - стор ) H&E фарбування жирових гістологічних зрізів. Шкала шкали = 20 мкм.

Повнорозмірне зображення

Вплив кефіру на ТГ і ТК

( ДО ) Вплив кефіру на рівні експресії мРНК ( до ) гени окислення ліпідів (PPARα і CPT1α) та ( b ) гени ліпогенезу (SREBP1, ACC та FAS) у тканинах печінки мишей ob/ob та мишей WT, оцінених за допомогою RT-PCR у реальному часі. Кількісні дані RT-PCR виражаються як середнє значення ± se (n = 6). * P ## P ## P –1 BW з кефіру демонстрував суттєво знижений рівень білків SREBP-1 (140%; P –1 BW з кефіру протягом 4 тижнів суттєво зменшував приріст BW та збільшував базальну швидкість метаболізму та загальні добові витрати енергії ( 1), але жоден із цих параметрів не був змінений у мишей WT. Ослаблений BW оброблених тварин може бути обумовлений наявністю зменшеної кількості жирової тканини та зменшенням розміру адипоцитів (таблиця 1, малюнки 2 та 3). Отже, Хо та співавт. 21 показали, що кефір опосередковує антиадипогенні ефекти завдяки інгібуванню диференціювання адипоцитів у клітинах 3T3-L1. Тому в цьому дослідженні очевидно, що BW мишей ob/ob з більшою кількістю адипоцитів, ніж миші WT з меншою кількістю адипоцити.

Повний розмір таблиці

Запропонований механізм кефір-опосередкованої модуляції ліпідного метаболізму у мишей ob/ob з синдромом печінкової НАЖХП. Вплив кефіру на жирову печінку мишей ob/ob може відбуватися через пригнічення метаболічних ферментів ліпогенного шляху, а не ліпідного окисного шляху. Діаграма показує, що кефір може інгібувати експресію білків SREBP-1, ACC та FAS під час синтезу холестерину.

Повнорозмірне зображення

На закінчення, це дослідження демонструє, що споживання 140 мг кг –1 БВ кефіру протягом 4 тижнів послаблювало приріст ЧБ та вміст GOT та GPT у сироватці крові мишей ob/ob. Крім того, кефір суттєво знижував експресію мРНК та білка SREBP-1, ACC та FAS, а також знижував синтез жирних кислот, вміст TG та накопичення TC у тканинах печінки оброблених мишей ob/ob. Отже, це дослідження продемонструвало, що захисний ефект кефіру на моделях жирової печінки ob/ob мишей виникає через інгібування печінкового ліпогенезу, а не шляхом сприяння утилізації ліпідів.