предметів

реферат

Головний

В останні роки було показано, що рецептор фарнезоїду X (FXR, також відомий як NR1H4), рецептор ядерної жовчної кислоти, що відіграє ключову роль у підтримці гомеостазу жовчних кислот. 2, 3, 4 FXR бере участь у контролі синтезу жовчних кислот у печінці та транспорту жовчних кислот за допомогою ентерогепатичної циркуляції. Цей ядерний рецептор експресується в печінці та кишечнику, а також в інших органах і тканинах, таких як наднирники та жирова тканина. 5, 6 Після активації печінковий FXR пригнічує синтез жовчних кислот шляхом транскрипційного зниження регуляції ферменту Cyp7A1, 7, 8, який каталізує перші та швидкісні етапи в первинному каскаді синтезу жовчних кислот. Попереднє дослідження з нашої лабораторії показало, що FXR-нульові миші показали, як очікувалося, підвищений рівень експресії гена cyp7A1 в печінці. Крім того, було показано, що ці миші мають збільшену швидкість синтезу холевої кислоти та збільшений розмір пулу холевої кислоти. 3

Однак, крім інгібуючої дії активованого FXR печінки, Cyp7A1 регулюється кількома іншими FXR-залежними та незалежними механізмами. Кілька чинників транскрипції, що залежать від ГОДИНИ, беруть участь у підтримці циркадної експресії Cyp7A1, тобто Dbp, Rev-erb та E4BP4. 9, 10, 11 Крім того, представляє інтерес опосередкований FXR метод контролю експресії печінкового Cyp7A1, опосередкований непрямою сигналізацією тонкої кишки. Індукована жовчною кислотою кишкова FXR індукує експресію фактора росту фібробластів миші 15 (Fgf15) 12 та його ортолога людини FGF19. На відміну від більшості інших білків Fgf, Fgf15/19 має слабку спорідненість до зв'язування з гепарином, що дозволяє йому уникати попереднього захоплення в позаклітинних матриксах. В результаті Fgf15, отриманий з кишечника, здатний досягати печінки та діяти як ендокринний фактор. Після активації його печінкового рецептора ізотип 4 рецептора Fgf (FGFR4), який вимагає p-Klotho як співрецептора для оптимальної функціональності, пригнічується експресією Cyp7A1. 14, 15

Кім та ін. 16 нещодавно порівняв метаболізм жовчних кислот у печінкових та кишкових специфічних мишей-нокаутів FXR, щоб вивчити відносний внесок печінкових та кишкових FXR у контроль синтезу жовчних кислот. Однак висновки Kim et al 16 базуються на лише відносно незначних відмінностях у рівні експресії генів. У цьому дослідженні ми розглядаємо відносний внесок шляху FXR-Fgf15 у синтез печінкової жовчної кислоти не тільки шляхом вивчення змін рівня експресії генів, але, що більш важливо, шляхом визначення впливу селективної делеції FXR в кишечнику на фізіологічні параметри. такі як утворення жовчі та кінетика ентерогепатичної циркуляції жовчних кислот. Крім того, відносний внесок кишкового сигнального шляху FXR-Fgf15 визначається під час модуляції подачі жовчних кислот шляхом подачі жовчних кислот та секвестрації жовчних кислот. Fgf15 сприяє регуляції синтезу жовчних кислот у мишей переважно під час темної фази. Розширення запасів жовчної кислоти, що циркулює, та секвестрація жовчних кислот зменшують роль кишкового сигналу FXR-Fgf15 у контролі синтезу жовчних кислот та виробництва жовчних кислот.

РЕЗУЛЬТАТИ

Характеристика кишкової селективної кишкової селективної Fxr нокаутованої миші

Профілі експресії мРНК Fxr та Fgf15 уздовж тонкої кишки аналізували за допомогою RT-PCR. Як показано на малюнку 1, експресія мРНК Fxr, як очікувалося, буде найвищою в дистальному відділі тонкої кишки мишей WT. Fgf15 експресувався переважно в дистальному відділі клубової кишки мишей WT, але його схема експресії не повністю відповідала експресії Fxr. Миші IFXR-KO продемонстрували практично повну відсутність Fxr та сильне зниження (середнє зниження: 82%) експресії Fgf15 уздовж кишки. Мішені FXR аналізували у трьох інстистінальних сегментах (проксимальному, середньому та дистальному) і виявили, що вони експресуються на нижчих рівнях тонкої кишки мишей iFXR-KO, тобто експресія Ibabp та Ost-α збільшується у напрямку до дистальної та кінцева клубова кишка зменшилася на 87 та 49% у мишей iFXR-KO (дані не наведені). Експресія клубової Asbt, яка, як відомо, не регулюється FXR у мишей, 4 збільшується в дистальному напрямку, не демонструючи відмінностей між двома групами. Показано, що Shp, важливий ген-мішень FXR у печінці, експресується переважно в проксимальній частині тонкої кишки в обох групах, і неможливо виявити різниці між iFXR-KO та контрольними мишами.

fgf15

Відносна картина експресії генів уздовж тонкої кишки. Тонку кишку самців мишей дикого типу (WT) (відкриті кола, n = 3) та самців кишкової селективної миші FXR (тверді кола, n = 3) промивали PBS і вирізали шість сегментів; 0, 33, 66, 83, 90 та 100% (відносна відстань від шлунка до дистальної частини клубової кишки). Відносні рівні експресії генів Fxr та Fgf15 порівняно з 18S аналізували за допомогою RT-PCR. Значення виражаються як середнє значення ± sd

Повнорозмірне зображення

У віці 3 місяців вага тіла та печінки мишей iFXR-KO була значно нижчою, ніж вага односеменних тварин (табл. 1), але співвідношення маси печінки до маси тіла не відрізнялося між групами. Спостережувані відмінності у масі тіла та масі печінки були незмінними, тобто вони спостерігались у всіх вікових категоріях від 4 до 28 тижнів і залишалися після годування певними дієтами (дані не наведені та додаткова таблиця S2). Окрім відносно незначного збільшення TCA-індукованого, між iFXR-KO та контрольними мишами не спостерігалось різниці в активності AST та ALT у плазмі крові (таблиця 1 та додаткова таблиця S2). Крім того, не спостерігалось відмінностей у морфології печінки між групами (рис. 2). Таблиця 1 також показує, що зниження маси тіла у мишей iFXR-KO не було обумовлено зменшенням споживання їжі. Миші з дефіцитом FXR у всьому тілі демонструють підвищений рівень ліпідів у плазмі крові 3, 4 з високим рівнем холестерину та тригліцеридів у плазмі крові. На відміну від цього, ми не виявили суттєвих відмінностей у вмісті ліпідів у плазмі або печінці між мишами WT та iFXR-KO, які отримували дієту (табл. 1).

Стіл в натуральну величину

Морфологія печінки на кормі, збагачена їжею 0,5% TCA або 2% Colesevelam HCl, що годується WT та мишами, вибіленими FXR кишечника. Гістологічне дослідження морфології печінки оцінювали шляхом фарбування гематоксиліном/еозином (див. «Матеріали та методи»). Морфологія печінки WT та вибраних кишечником FXR мишей-нокаутів, збагаченої їжею 0,5% TCA або 2% Colesevelam HCl представлена ​​зі збільшенням у 20 разів. '*' Представляє перипортальні гепатоцити; # представляє перицентральні гепатоцити.

Повнорозмірне зображення

Залежні від часу ефекти кишково-селективного дефіциту Fxr на печінковий cyp7A1 та кишкову експресію Fgf15 \ t

Зважаючи на добре відомий добовий ритм експресії печінкового Cyp7A1, 3, 13, 23, ми досліджували вплив дефіциту кишкової FXR на щоденну експресію печінкового Cyp7A1 у чотири різні часові моменти, тобто в 0100, 0700, 1300 та 1900 годин. . Різних статей між статями не спостерігалось (дані щодо чоловіків не наведені).

На початку темного періоду (1900 годин) експресія печінки Cyp7A1 була найвищою в обох групах, як і очікувалося (рис. 3). Експресія Cyp7A1 була значно вищою лише вночі (1900 - 0700 годин) у мишей iFXR-KO порівняно з контролем WT. Експресія Cyp8B1, необхідна для виробництва холевої кислоти, не демонструвала чітких змін протягом ночі і не суттєво впливала на мишах iFXR-KO. Крім того, ніяких відмінностей у експресії Fxr та Shp в печінці між двома групами не спостерігалося. Спостерігаючи цей залежний від часу ефект IFXR-дефіциту на експресію Cyp7A1, ми запитали, чи відсутність кишкової сигналізації FXR та Fgf15 діє через фактори транскрипції (Dbp, Rev-erbα та/або E4bp4), що беруть участь у регуляції циркадної ритмічності Cyp7A1. вираз. На малюнку 3 показано, що ці фактори транскрипції мали виразний циркадний профіль у своєму профілі експресії, але моделі експресії були дуже подібними в обох штамів. Лише Dbp та Rev-erbα показали підвищену експресію у мишей WT в один момент часу (1900 годин), що явно не пояснює відмінності експресії Cyp7A1 .

Циркадний профіль експресії генів, що беруть участь у регуляції синтезу жовчних кислот. Рівні експресії генів (порівняно з експресією 18S) вимірювали у чотири часові моменти (0700, 1300, 1900 та 0100 годин) у 6-7 самок контрольованих дикого типу (відкриті кола) або у жіночих кишкових селективних мишей-нокаутів FXR (закриті кола). Дані показані як середнє значення ± sd Cyp7A1 та Cyp8B1 є ключовими ферментами в синтезі жовчних кислот, Shp є другим месенджером FXR та Dbp, Rev-erbα та E4bp4 беруть участь у підтримці добового ритму експресії Cyp7A1. '#' Представляє суттєву різницю з P

Добовий профіль експресії кишкового гена. Рівні експресії генів (відносно 18S) вимірювали в чотири часові моменти (0700, 1300, 1900 і 0100 годин) у кінцевій клубовій кишці ∼ 4 см, проксимально до ілеоцекального сфінктера, або у контрольних самок дикого типу (відкриті кола), або у жіночої кишки - селективні FXR нокаутовані миші (замкнені кола); N = 4. Дані виражаються як середнє значення ± sd Fgf15 - фактор росту, експресія якого індукується активним кишковим FXR; Ibabp, зв’язуючий білок жовчної кислоти клубової кишки, є кишковим цільовим геном FXR. '#' Представляє суттєву різницю з P

Жовчний потік ( a ) та виробництво більярду ( b - d ) у мишей дикого типу (WT) та кишкових селективних FXR-нокаутованих мишей, яких годували або збагаченою їжею їжею, 0,5% TCA або 2% HCl. Після 0,5% дієти, збагаченої ТСА, або 2% дієти, збагаченої 2% колесевеламом HCl протягом трьох та 7 днів відповідно, мишей (N = 5) піддавали канюляції жовчі. В результаті було досягнуто відтік жовчі та продуктивність жовчних проток. Відкриті колони: односмітники WT, закриті колони: миші, що вибирають кишковий селективний FXR. Значення виражаються як середнє значення ± sd '*' Представляє статистичну значимість P # є статистичною значимістю (P

Вплив кишкової селективної недостатності FXR на деградацію [2H4] -холату ( a ), розмір контейнера b ), дробовий коефіцієнт обороту c ) і швидкість синтезу ( d ). Мишей піддавали канюляції жовчі, як описано в розділі Експериментальні процедури. ( a - d ) отримані на основі вимірювань збагачення ізотопу [2H4] -холату у плазмі дикого типу (WT) та мишах, вибілених кишечником FXR. N = 6 на штам: миші WT (відкриті смуги) та кишкові селективні FXR-нокаутовані миші (закриті бруски). Дані виражаються як середнє значення ± SD # суттєва різниця (P 30-кратна) та Fgf15 (> 30-кратна) вираз у кінцевій клубовій кишці контролю. миша. Відмічено порівняно невелике збільшення експресії Shp у печінці, виключно у мишей iFXR-KO. Однак на малюнку 7 показано чітке регулювання зниження експресії Cyp7A1 та Cyp8B1 як у контрольних, так і у мишей iFXR-KO, хоча зниження регуляції Cyp7A1 не досягло статистичної значущості у мишей WT.

Ми спостерігали стабільне незначне зниження маси тіла у мишей iFXR-KO (

15%), про які не згадували Кім та ін. Оскільки відмінностей у споживанні їжі та вмісті енергії у фекаліях не виявлено (дані не наведені), це, швидше за все, відображатиме зміни споживання енергії у мишей iFXR-KO. Цей несподіваний наслідок дефіциту iFXR наразі досліджується.

Загальновідомо, що експресія печінки Cyp7A1 демонструє помітний добовий ритм. Показано, що експресія 3, 13, 23 Cyp7A1 зростає виключно у мишей iFXR-KO протягом активного нічного періоду, коли експресія Fgf15 висока у мишей WT. Оскільки відмінностей у експресії печінкових Fxr та Shp між цими двома групами не спостерігалось, це збільшення вмісту Cyp7A1 у мишей iFXR-KO пояснюється цими мишами, що експресують Fgf15 із низьким кишковим кишечником, що є прямим наслідком дефіциту FXR кишечника, як підтверджено. дослідження кишкової експресії Ibabp. Ми прийшли до висновку, що кишковий FXR через Fgf15 регулює синтез жовчних кислот переважно вночі, що узгоджується з Houten et al. 25, який показав, що кишковий FXR є найактивнішим протягом ночі, використовуючи трансгенну репортерну мишу FXR люциферази. 25

Незважаючи на залежний від часу ефект на експресію Cyp7A1, миші iFXR-KO мають загальний збільшений розмір басейнів холевої кислоти. Як результат, секреція жовчної кислоти була збільшена, що в свою чергу призвело до збільшення потоку жовчі та виходу фосфоліпідів. Це узгоджується з результатами Yu та співавт. Ці автори повідомляли, що миші з дефіцитом Fgfr4, тобто без печінкової сигналізації Fgf15, також показали збільшений розмір басейнів жовчних кислот і вищу швидкість секреції гепатобіліарної жовчної кислоти, ніж їх контроль.

Після годування м’яко збагаченою дієтою, збагаченою жовчними кислотами, секреція жовчних кислот збільшилася в обох групах, пов’язана із збільшенням секреції фосфоліпідів та холестерину. Оскільки кишковий FXR порушений у мишей iFXR-KO, ми не очікували зниження експресії печінкової Cyp7A1 у цих мишей. Однак збільшення жовчних кислот призвело до зниження регуляції Cyp7A1, що не досягло статистичної значущості у мишей WT та Cyp8B1 в обох генотипах. Невелике збільшення експресії Fgf15 клубової кістки у поєднанні зі збільшенням експресії Shp печінки може пояснити спостережуване зниження експресії Cyp7A1 у мишей iFXR-KO. Що ще важливіше, більшість відмінностей між двома штамами, що спостерігаються при утворенні жовчі, були мінімізовані, що означає, що досить незначне збільшення потоку жовчних кислот через печінку (+ 30%) має перевагу над регулюючою роллю кишкового Fgf15.

Після секвестрації жовчних кислот у кишковому тракті секреція жовчних кислот зменшилася в обох групах, що призвело до зменшення потоку жовчі та фосфоліпідів та секреції холестерину. Відповідно до дієти, збагаченої ТСА, більшість спостережуваних відмінностей між двома штамами у стані годівлі були мінімізовані. На рівні експресії гена секвестрація жовчних кислот спричинила зниження експресії Fgf15 в кишечнику, що призвело до підвищення рівня мРНК cyp7A1 та Cyp8B1 в печінці. Однак у мишей WT не можна виключати внесок зменшення печінкової експресії Shp .

Наше дослідження показує, що продукція кишкового FXR-опосередкованого Fgf15 сприяє синтезу жовчних кислот, особливо в темряві, коли кишкова активність FXR висока. Порушення кишкової FXR призводить до збільшення розміру резервуару холевої кислоти, що призводить до збільшення секреції жовчних кислот і, отже, збільшення виведення жовчі та фосфоліпідів. Модуляція запасів жовчних кислот шляхом доповнення або секвестрації жовчних кислот у кишковому тракті мінімізує роль кишкового сигналу FXR-Fgf15, який присутній у звичайних дієтичних умовах.