lncrna

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Дефіцит SRA збільшує регуляцію печінкової експресії ATGL
  • Рівні ATGL і SRA опосередковано регулюються в стані мишей натощак
  • SRA інгібує трансактивацію промотору ATGL за допомогою Fox01
  • Інгібуючий ефект SRA на транскрипцію ATGL не залежить від інсуліну
  • SRA інгібує трансактивацію промотору ATGL за допомогою PPARγ
  • обговорення
  • методи
  • Тварини та дієта
  • Вилучення РНК та кількісна ПЛР у реальному часі
  • імуноблотинг
  • Культура клітин та лікування
  • Аналіз плазмід, трансфекції, ретровірусної інфекції та репортерних генів
  • Глушення генів за допомогою короткої шпильки РНК (shRNA)
  • Аналізи β-окислення FFA, опосередковані ATGL
  • Аналізи активності ATGL
  • Аналіз TAG в гепатоцитах
  • Статистичний аналіз
  • Список літератури
  • Дякую
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

  • Сигналізація про інсулін
  • Механізми захворювання
  • Транскрипційні регулятивні елементи

реферат

Безалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП), найпоширеніша форма хронічного захворювання печінки, проявляється надмірним накопиченням жиру в печінці. Нещодавно ми показали, що миші з генетичним нокаутом довгого некодуючого РНК (lncRNA) активатора РНК стероїдного рецептора (SRA) (SRAKO) стійкі до ожиріння, спричиненого ожирінням, з фенотипом, що включає поліпшену толерантність до глюкози та ослаблений стеатоз печінки ... механізм був досліджений у цьому дослідженні. Ми виявили, що рівні SRA та жирної тригліцерид-ліпази (ATGL), основної гідролази печінкового триацилгліцерину (TAG), регулюються голодуванням у мишей, а експресія ATGL у печінці індукується SRAKO на нормальній дієті з високим вмістом жиру (HFD) . ) годування. Втрата SRA у первинних гепатоцитах або клітинній лінії гепатоцитів підвищує регуляцію, але примусова експресія SRA пригнічує експресію ATGL та β-окислення вільних жирних кислот (FFA). SRA пригнічує активність промотору ATGL, зокрема, інгібуючи індукуючий вплив фактора транскрипції, білка вилки O1 (FoxO1). Наші дані виявляють нову функцію SRA у сприянні стеатозу печінки шляхом придушення експресії ATGL.

Нещодавно довгі некодуючі РНК (lncRNA) стали важливими регуляторами різних біологічних процесів, включаючи плюрипотентність стовбурових клітин, ембріогенез, диференціювання клітин 12, 13 та метаболізм печінкових ліпідів 14. Активатор РНК-стероїдного рецептора (SRA) спочатку характеризувався як lncRNA, який функціонує як РНК-коактиватор для збільшення експресії гена, залежного від рецепторів стероїдних ядер. Згодом було показано, що SRA функціонує як РНК-коактиватор для нестероїдних ядерних рецепторів 16, 17 і відіграє важливу роль у міогенезі 18, 19, стероїдогенезі 20, пухлинах молочної залози 21, 22, 23 та кардіоміопатії 24. Ген Sra1 також продукує альтернативну розшифровку, яка кодує білок, позначений SRAP 25, 26, хоча функція SRAP в основному невідома.

Нещодавно ми показали, що SRA сприяє диференціації адипоцитів та стимульованому інсуліном поглинанню глюкози в адипоцитах in vitro за допомогою багатьох механізмів, таких як коактивація транскрипційної активності рецептора γ (PPARγ), що активується проліфератором пероксисоми, інгібування експресії генів запальних генів, пов’язаних з рецептором адипоцитів 27, або просування, 28. Щоб оцінити функцію SRA in vivo, ми генерували глобальних мишей з нокаутуючими генами Sra1 (SRAKO) 29. На додаток до зменшення ваги жиру, миші SRAKO знижували рівень TAG в печінці та стійкість до ожиріння, спричиненого дієтою. Вперше ці дані свідчать про роль SRA у метаболізмі ліпідів у печінці 29. Тут ми з’ясовуємо механізм, показуючи, що SRA пригнічує транскрипційну активність білка-вилки O1 (FoxO1) через незалежний від інсуліну шлях у гепатоцитах, зменшуючи тим самим експресію його гена ATGL, ключового ліполітичного ферменту, і згодом знижуючи β гепатоцити FFA.

результат

Дефіцит SRA збільшує регуляцію печінкової експресії ATGL

У 4 рази у мишей WT-HFD a

У 2 рази у лептинодефіцитних мишей (ob/ob) порівняно з мишами WT-Chow (рис. 3а, ліва панель)). На відміну від цього, у стані насичення рівні SRA були відносно вищими і не змінювались при дефіциті HFD або лептину.

( a ) Визначали рівні мРНК SRA та ATGL у печінці мишей WT-chow (n = 5) або WT-HFD (n = 6) та мишей ob/ob (n = 8) (у віці 20 тижнів), які голодували або годували за допомогою RT-qPCR. Рівні MRNA нормалізувались до експресії 36B4. Дані представлені як середнє значення ± SE та виражаються як кратна зміна щодо мишей WT-chow. ( б, с ) Екстракти печінки або печінки мишей WT-chow, WT-HFD та ob/ob іммуноблотували анти-Fox01, анти-ATGL, анти-laminB1 та анти-β-актинові антитіла. b ) Миші натощак. c ) миші в кормі. ( d ) Ядерні екстракти печінки мишей WT або SRAKO (KO), яких годували чау або HFD, імуноблотували антитілами проти Fox01 та anti-laminB1. ( б - д ) Показані праві панелі, кількісне визначення смуг в імуноблотах. * стор. 33. Крім того, відсутність SRA не вплинуло на вміст ядерного білка FoxO1 у печінці (рис. 3d). Ці результати свідчать про те, що SRA регулює експресію ATGL за допомогою механізму, який не передбачає зміни рівня ядерного FoxO1.

SRA інгібує трансактивацію промотору ATGL за допомогою Fox01

Добре відомо, що Fox01 має сайти зв'язування в промоторній області -3 kb гена ATGL і посилює регуляцію транскрипції ATGL в адипоцитах 33. Fox01 регулює як вироблення глюкози в печінці, так і метаболізм ліпідів 34, 35. Надмірна експресія Fox01 підвищує рівень мРНК та білка ATGL у клітинах hepa1-6 (рис. 4а), припускаючи, що транскрипція ATGL безпосередньо регулюється FoxO1 у гепатоцитах. Для подальшої оцінки ми використовували промотор люциферази-репортера ATGL з промотором 3 kb і виявили, що цей вектор демонструє в 75 разів вищу активність люциферази, ніж контрольний рівень базового рівня pGL3 (рис. 4b). Котрансфекція плазміди, що кодує РНК SRA, але не інгібіровану білком SRAP люциферазу, зумовлену промотором ATGL

25% (рис. 4в). Щоб підтвердити, чи проявляє SRA свій інгібуючий ефект через Fox01, Fox01 та SRA були котрансфіковані системою люциферази (рис. 4г). Як і слід було очікувати, лише Fox01 збільшив люциферазу, що рухається промотором ATGL, до 5 разів, але котрансфекція SRA пригнічувала цей опосередкований Fox01 ефект (рис. 4г). Здатність SRA інгібувати опосередковану Fox01 активність люциферази залежала від дози (рис. 4д). Крім того, інгібітор Fox01 AS1842856 (1 мкМ) викликав безперервне пригнічення активності Fox01 (додаткова фігура S4a) та зменшив інгібуючий ефект SRA на активність промотору ATGL (рис. 4f). На відміну від надмірної експресії SRA, нокдаун SRA збільшив активність промотору ATGL (рис. 4g, h), що запобігло AS1842856 (рис. 4h). Загалом, ці дані свідчать про те, що SRA регулює експресію ATGL, пригнічуючи здатність Fox01 сприяти транскрипції ATGL.

ATGL є основною печінковою гідролазою TAG, яка контролює окислення FFA у печінці 8, 9. Він має вищу субстратну специфічність для TAG, ніж для гормоночутливої ​​ліпази (HSL), яка раніше вважалася домінуючою TAG гідролазою 46. У цьому дослідженні ми виявили, що SRAKO підвищує рівень мРНК та білка в печінковому ATGL як у HFD, так і в нормальному годуванні кормами (рис. 1). Крім того, експресія ATGL була індукована в гепатоцитах SRAKO (рис. 2а), що призвело до підвищення активності ферментів ATGL у печінці (додатковий малюнок S2) та активації вироблення в організмі кетонів гепатоцитів (рис. 2b), продукту та показника Β-окислення FFA. Подібні результати також були знайдені в клітинній лінії гепатоцитів Hepal-6 з нокдауном ендогенного SRA (рис. 2в, г). Навпаки, примусова експресія SRA пригнічувала експресію ATGL та зменшувала β-окислення FFA (рис. 2д, f). Важливо, що ми демонструємо, що SRA індукується ожирінням печінки після голодування (рис. 3а) і що рівні SRA та ATGL у печінці опосередковано корелюються у мишей WT-Chow, WT-HFD та ob/ob (рис. 3a). B) . Таким чином, рівні SRA змінюються залежно від рівня енергії та обмінних умов, що призводять до зворотної експресії ATGL у печінці.

Фактор транскрипції Fox01 індукує експресію ATGL в адипоцитах 33 та гепатоцитах (рис. 4а). Поєднання підходів, що включає генетичний нокаут in vivo, надмірну експресію, нокдаун та дослідження інгібіторів у культивованих клітинах, свідчить про те, що SRA інгібує транскрипцію ATGL, втручаючись у транскрипційну активність Fox01 (рис. 1, 3 та 4).

В адипоцитах інсулін індукує вивільнення Fox01 з ядра в цитоплазму, інгібуючи тим самим транскрипцію ATGL33. Попередні дослідження з адипоцитами 27, 28 та сучасне дослідження з гепатоцитами (рис. 5а) показують, що SRA стимулює інсуліно-індуковане фосфорилювання Akt, Erk1/2 та їх цільової мішені FoxO1, що, судячи з усього, суперечить нашим попереднім даним, що SRAKO ослаблював інсулін. Індукований HFD опір 29. Однак покращена чутливість до інсуліну у мишей SRAKO, ймовірно, буде вторинною щодо ослаблення печінкового стеатозу та ожиріння. Інсулін та SRA інгібують опосередковану Fox01 транскрипцію ATGL, але механізми відрізняються, оскільки лише інсулін індукує експорт ядер Fox01 (рис. 5b), а репресивний ефект SRA не залежить від інсуліну. Можливо, вплив SRA на стимулювання передачі сигналів інсуліну занадто малий, щоб модулювати ядерну локалізацію Fox01, принаймні за умов цього дослідження.

Підтверджено, що PPARγ, інший фактор транскрипції, що регулює транскрипцію ATGL в адипоцитах 39, 47, має подібний ефект у гепатоцитах при активації лігандом PPARγ (рис. 6а). Однак підвищена транскрипція ATGL за допомогою PPARγ-активованого ліганду була знижена до базальних рівнів за допомогою SRA (рис. 6b), ефект, незалежний від Fox01 (рис. 6c). Незважаючи на потенційну важливість шляху SRA-PPARγ-ATGL, дослідження з використанням інгібіторів Fox01 та PPARγ дозволяють припустити, що за відсутності ліганду PPARγ, SRA опосередковує свої репресивні ефекти на транскрипцію ATGL за допомогою Fox01, а не PPARγ (Рисунки 4 та 6).

Молекулярний механізм, що лежить в основі SRA, який діє як репресор у транскрипції ATGL, опосередкованій Fox01 та PPARγ, залишається повністю розкритим. Попередні дослідження припускають, що SRA може функціонувати як РНК-коактиватор, комплексуючись з білковими коактиваторами, такими як SRC-1 15, і що він може функціонувати як молекула каркасу 19, 20, 48 у цих комплексах. Однак SRA також виконує репресивну функцію і взаємодіє з NR-корепресорами SHARP 49 і SLIRP 50 і діє як ешафот репресивних комплексів, що містять HP1, LSD1, HDAC1/2 і CoREST, щоб заглушити гени, регульовані прогестероновим рецептором, за відсутності гормонів 51. Крім того, SRA може утворювати комплекси з групами тритораксу та комплекси полікомбі-репресора 2 для доставки або активуючих, або репресивних модифікацій гістону 52. Отже, SRA може виконувати функції коактивації та репресії залежно від свого контексту. Ми припускаємо, що в печінці SRA діє як риштування для набору репресивного комплексу для придушення транскрипції AT01, опосередкованої Fox01 та PPARγ.

Підводячи підсумок, це дослідження показує, що експресія SRA та ATGL у печінці обернена кореляцією, і втрата SRA у печінці або гепатоцитах миші підвищує експресію ATGL, головним чином, сприяючи індуктивному ефекту FoxO1, що може призвести до збільшення рівня FFA β-окислення та забезпечують захист від стеатозу печінки при ожирінні, спричиненому дієтою.

методи

Тварини та дієта

Мишей SRAKO генерували, як описано раніше 29. Мишей з дефіцитом лептину (ob/ob) придбали у Модельному дослідницькому центрі тварин Нанкінського університету, Китай. Мишей розміщували у безбаргенному бар’єрному приміщенні з 12-годинним циклом світло/темрява та отримували вільний доступ до їжі та води. У віці 8 тижнів мишей SRAKO (KO) та однолітніх підстилок (WT) годували або стандартною лабораторною дієтою чау-чау (Chow) (Xietong Organism, Нанкін, Китай), або дієтою з високим вмістом жиру (HFD, 60% жиру), 20% вуглеводів, 20% білка; Research Diets, Нью-Брансвік, США) протягом 12 тижнів. ob/ob мишей годували чау-дієтою до 20 тижнів. Мишей забивали під час легкої фази після позбавлення їжі протягом 16 год або без голодування. Тканини негайно виділяли, зважували та зберігали у рідкому азоті. Всі тваринництво та експерименти на тваринах відповідали керівним правилам Нанкінського медичного університету Регламенту експериментів на тваринах і були затверджені Комітетом з експериментів на тваринах Медичного університету Нанкіна.

Вилучення РНК та кількісна ПЛР у реальному часі

Загальну РНК виділяли з печінки або клітин за допомогою RNAiso Plus (Takara Bio Inc., Далянь, Китай) та реверсували транскрипцію за допомогою зворотної транскриптази M-MMLV з інгібіторами ринануклеази RNasin (Promega Biotech Co., Ltd, Пекін, Китай). протоколи виробника. qPCR проводили за допомогою SYBR Premix Master Mix (Thermo Scientific Inc., Шанхай, Китай). Послідовності праймерів для Pparα, Mcad, Lcad, Cpt1α, Cpt2, Cd36, Fatp1, L-fabp, Acsl1, Acox1, Acaa1b, Acaa2, Atgl, Hsl, Acly, Fasn, Acc1, Acc2, Scd1, Mtgpat1, Dgat1, Dgat1, Mttp, Apoc2, Apoc3, Vldlr та Sra зведені в додатковій таблиці S1. Рівні експресії мРНК були нормалізовані до рівня рибосомного білка, великої мРНК P0 (36B4).

імуноблотинг

Білки з лізатів печінки, клітинних лізатів, клітинного ядра та клітинної цитоплазми витягували попередніми методами 53 або наборами (Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай). Первинні антитіла використовували у розведенні 1: 1000. Антифосфо-FoxO1 (# 9461), FoxO1 (# 2880), фосфо-ERK1/2 (# 4370), ERK1/2 (# 4695), фосфо-Akt (Thr308) (# 9275), фосфо-Akt (Ser473 ) (# 9271), Akt (# 4685), ATGL (# 2439), PPARγ (# 2435), ламін B1 (# 13435), β-актин (# 3700) та кон'югований проти мишачого або кролячого IgG кон'югований з пероксидазою хрону придбані у технології стільникової сигналізації. Антитіло проти SRAP (# A300-743A) було придбано в Bethyl Laboratory, Inc.

Культура клітин та лікування

Клітини гепатокарциноми людини HepG2 та клітини гепатокарциноми миші Hepa1-6 культивували в модифікованому середовищем Eagle Dulbecco (DMEM; Invitrogen), доповненому 100 мг/мл стрептоміцину сульфату (Sigma - Aldrich), 100 U/мл пеніциліну G (Sigma - Aldrich) та 10% (об/об) фетальної бичачої сироватки (FBS; Invitrogen) і підтримується при 37 ° C в атмосфері 5% CO 2 і 95% повітря. Первинні гепатоцити були виділені від мишей дикого типу або SRAKO і вирощені в середовищі Вільгельма Е (Sigma - Aldrich) з FBS та антибіотиками, як описано раніше 54. Клітини голодували в сироватці протягом 5 год з подальшим лікуванням інсуліном або без нього (10 нМ) протягом 5 хв. Перед лікуванням інсуліном клітини попередньо обробляли MG132 (Sigma - Aldrich, 50 мкМ), вортманініном (Sigma - Aldrich, 1 мкМ) або траметинібом (MedChem Express, 1 мкМ) протягом 30 хв.

Аналіз плазмід, трансфекції, ретровірусної інфекції та репортерних генів

Глушення генів за допомогою короткої шпильки РНК (shRNA)

Згідно з попередніми методами 27, ендогенний мишачий SRA в клітинах Hepa1-6 був збитий зараженням лентивірусом, що експресує shRNA, спрямованим проти SRA, що генерується в клітинах 293T, доповнений 8 мг/мл полібрену (Sigma) після прикріплення протягом ночі. Інфікування повторювали з інтервалом від 8 до 12 годин. Клітини піддавали експериментам через 72 год після другого зараження.

Аналізи β-окислення FFA, опосередковані ATGL

Гепатоцити або клітини Hepa1-6 культивували в повному середовищі з олеїновою кислотою (100 мкМ) протягом 16 год. Потім клітини інкубували у сироватці без фенолу червоного та без глюкози DMEM (Sigma) протягом 4 год з (R) -бромоенолом лактоном або без нього (25 мкМ, компанія Cayman Chemical, Ann Arbor, США). Кетонові тіла, продукти бета-окислення FFA, що виділяються в середовище, аналізували за допомогою набору для аналізу D-3-гідроксибутиратів (Megazyme Internatioanl Ireland, Bray, Ireland). ATGL-опосередковане β-окислення FFA розраховували як різницю у виробництві D-3-гідроксибутирату між клітинами, обробленими специфічним інгібітором ATGL або без нього, (R) -бромоєнолом лактоном, нормалізованим до рівня клітинного білка, тобто частки D-3 -продукція гідроксибутирату, пригнічена за допомогою (R) -бромоєнолу лактону.

Аналізи активності ATGL

Активність гідролази TAG у лізатах печінки аналізували за допомогою набору для аналізу гідролази TAG (Інститут біоінженерії Цзяньчен, Нанкін, Китай) та нормалізували до рівня білка лізату печінки. Активність ATGL розраховували як різницю активності гідролази TAG у присутності та відсутності лактону (R) -бромоєнолу (25 мкМ), тобто частку активності гідролази TAG, пригнічувану лактоном (R) -бромоєнолу.

Аналіз TAG в гепатоцитах

Гепатоцити гомогенізували в 0,1 М HCl і екстрагували хлороформом-метанолом (2: 1). Органічну фазу випарювали досуху. Залишки ліпідів розчиняли в ізопропанолі та вимірювали за допомогою набору для аналізу TAG (GPO-PAP; Dongou Bioengineering Co. Ltd, Веньчжоу, Китай). Рівні TAG нормалізували до рівня білка в гепатоцитах.

Статистичний аналіз

Результати виражаються як середнє значення ± SE. Дані між групами аналізували за допомогою t-критерію Стьюдента або одностороннього ANOVA з подальшим множинним порівнянням Бонферроні - Данна. Відмінності вважали значущими для Р