Резюме
Кишкова непрохідність - це часткова або повна непрохідність кишечника, яка може спричинити сильний біль у животі, нудоту, блювоту та перешкоджати проходженню стільця. Ця процедура створення часткової кишкової непрохідності у мишей є надійною при вивченні механізмів патологічного росту та загибелі клітин у кишечнику.
Анотація
Вступ
Кишкова непрохідність - це часткова або повна непрохідність тонкої або товстої кишки, яка перешкоджає перетравленню їжі, рідин та газів через кишечник 1. Через непрохідність закупорка призводить до потовщення стінок кишечника, звуження просвіту 2. Непрохідність кишечника може виникнути в результаті операцій на животі або малому тазу, які спричиняють утворення тканин внаслідок спайок черевної порожнини або розладів шлунково-кишкового тракту, таких як запальні захворювання кишечника (хвороба Крона), дивертикуліт, грижа, вульва, стриктура, інвагінація кишечника, запор, ураження калу, псевдо- обструкція, пухлини та рак 3, 4, 5. Кишкова непрохідність у цих випадках часто призводить до гіпертрофії оболонки м’язової оболонки кишечника 6 .
РО просвіту індукує розтягнення кишечника і збільшує товщину гладком'язового шару навколо непрохідності у відповідь на необхідність дотримуватися функціональної перистальтики 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13. Тваринні моделі кишкового ПО були розроблені для вивчення гіпертрофії гладких м’язів у мишей 7, щурів 10, морських свинок 11, собак 12 та котів 13, які постійно розвивають подібну гіпертрофію в шарах кишкової м’язи.
Тут ми пропонуємо мишачий протокол для хірургічної операції на кишечнику з використанням силіконового кільця. Миші, які отримують хірургічне втручання, надійно гіпертрофують оболонку м’язової кишки. У гіпертрофічних м'язах клітини SMC, ICC, PDGFRα + та нейрони різко переробляються.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Наступний протокол затверджений Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (IACUC) при Університеті Невади Рено (UNR) Ресурси та відповідає всій етиці щодо використання дослідних тварин.
- Отримати зрілих мишей C57BL/6 (віком 4-6 тижнів) між 20-30 г. будинок колонії лабораторних мишей у централізованому центрі тварин за ресурсами УНР.
2. хірургія часткової непрохідності
Примітка: Операції проводяться в приміщенні, відведеному для хірургічних процедур. Усі хірургічні інструменти перед операцією автоклавуються. Стерильні хірургічні рукавички та халати повинні постійно носити весь персонал хірургічного кабінету.
3,0 поздовжньо скальпелем з 15 лезами, забезпечуючи поріз лише шкіри та уникаючи порізів в м’язово-очеревинному шарі в цей час. За допомогою щипців та хірургічних ножиць обережно відокремте шкіру від м’язово-очеревинного шару, не викликаючи розрізів м’язово-очеревинного шару. Після того, як шари достатньо відокремилися (приблизно 1 см x 4 см), визначте linea alba у м’язово-очеревинному шарі та виріжте
2 см вздовж linea alba, щоб оголити внутрішньочеревну порожнину за допомогою мікро-щипців та ножиць.
3. спостереження після операції.
- Після завершення операції переведіть тварин до інкубатора в приміщенні для відновлення, де регулюються температура та вологість. Спостерігайте за тваринами після операції кожні 15 хвилин протягом першої години, а потім кожні 30 хв протягом другої години, поки тварини знаходяться в інкубаторі.
- Як тільки призначене спостереження завершиться, переведіть тварин до їхньої індивідуальної клітки та щодня контролюйте їх на наявність клінічних ознак болю 18 та переконайтеся, що рана належним чином заживає без ознак ускладнень (розшарування).
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Малюнок 1. Хірургічно індукована часткова кишкова непрохідність на мишачій моделі. PO був індукований хірургічним втручанням. Одномісячних мишей знеболювали, живіт розрізали розрізом, навколо клубової кишки накладали силіконове кільце, а отвір закривали швом. Миші, які перенесли операцію, змогли відновитись через 8 або 13 днів. Миші, що відповідали віку та статі, функціонували так само, як миші PO, за винятком того, що не було розміщення кільця. (ДО) Неопрацьовані зображення шлунково-кишкового тракту у мишей, які перенесли хірургічне втручання через PO або SO Візуалізація мишей на 8 та 13 день після операції (B) Розсічений ЖКТ від мишей А. тонкої кишки вище за кільце розтягували через 8 та 13 днів після операції після РО, а фекальні гранули в товстій кишці також були нижчими за дві 8 та 13 доби після операції після РО порівняно з 13-денною після Миші для хірургічної операції для частково обструктивного силіконового кільця. Шкала масштабу 0,5 см. натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Малюнок 2. Змінений шар гладких м’язів на хірургічній мишачій моделі. Репрезентативне фарбування H&E клубових відділів кишкових PO, засмаглих та непрацюючих (NO) мишей. Гладенькі м’язи (SM) та слизові шари (Mu) товщі у PO мишей на 8 та 13 дні після операції після PO, ніж на SO та NO мишах. Вони складають шкали масштабу 50 мкм. натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Рисунок 3. Динамічне ремоделювання клітин при гіпертрофії гладких м’язів, спричиненій частковою кишковою непрохідністю. Репрезентативний конфокальний лазерний сканер зображень гіпертрофічних відділів клубової кишки, також з РО, і без мишей. Імуногістохімічне фарбування антитілами (червоним) до MYH11 (SMC), KIT (ICC), PDGFRA (PDGFRα + клітини) або PGP9.5 (NC; нейронні клітини), забарвлене DAPI (синім). SMC у м’язовій оболонці слизової оболонки (MM), циркулярному м’язі (CM) та поздовжніх м’язових шарах (LM), а також клітинах PDGFRα + глибокого м’язового сплетення (DMP), міентеріальної області (MY) та субсерозальної області (SS) ) зростали в гіпертрофічній клубовій кишці через 8 і 13 днів після ПО після дегенерації хірургічного втручання, в той час як ВМК при ДМП та моєму СС, міентеріальному сплетенні (МП), підслизовому сплетенні (СП), субсерозальному НК (СС) та кишкових моторних нейронах (РЕМ). Вони складають шкали масштабу 50 мкм. натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Рисунок 4. Результати силіконових кілець, які є занадто великими, замалими або недоречними в товстій кишці. (ДО) Гіпертрофія негладких м’язів стає клубовою кишкою, якщо кільце занадто велике, щоб викликати обструкцію. Кільце практично не перешкоджає клубової кишці. (B) Ішемія кишечника розвивається в клубовій кишці, якщо кільце занадто мало. Кільце робить майже повну непрохідність клубової кишки, що може пошкодити тканини і призвести до ранньої смерті до розвитку гіпертрофії. (C) Гіпертрофія гладких м’язів розвинулася в товстій кишці через неправильне розміщення кільця. Кільце в товстій кишці переміщується просвітним вмістом (фекаліями), який пошкоджує судинну область брижі і викликає масивні крововиливи в товсту кишку. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Ми показали, що у мишей, які отримують послідовну та відтворювану операцію на кишкових РО, розвивається гіпертрофія гладких м’язів кишечника, що імітує кишкову непрохідність людини. Хірургія непрохідності кишечника розроблена для різних тварин, включаючи 7 мишей, 10 щурів, 11 морських свинок, 12 собак та 13 котів. Мишача модель кишкової непрохідності має час, вартість, розмір та фенотипові переваги перед іншими моделями більших тварин. Розвиток гіпертрофії у мишей або щурів займає лише 10-14 днів 10 порівняно з 2-4 тижнями у морських свинок, собак та котів 11, 12, 13. Вартість придбання та обслуговування мишей також є величезною фінансовою перевагою порівняно з іншими моделями. Крім того, миші маленькі та легко піддаються хірургічному втручанню. Найголовніше, що у мишей, які отримують РО хірургічне втручання, широко і поступово розвивається гіпертрофія в кишечнику, тоді як у інших більших тварин менш значний ріст.
Цей протокол хірургічної операції вважається основною операцією для мишей. Усі хірургічні інструменти та витратні матеріали перед використанням слід стерилізувати, а хірургічне втручання повинно проводитися в чистому середовищі спеціальної операційної, щоб мінімізувати забруднення, що може призвести до зараження та запалення у мишей. Крім того, після операції мишам буде дано знеболюючий препарат. Ми вирішили використовувати версію бупренорфіну з уповільненим вивільненням, яка діє до 7-8 годин. Також після операції мишам важко пережовувати і ковтати тверду їжу. Для хірургічного втручання через 5 днів мишам слід давати м’яку їжу (тверда дієта з невеликою кількістю води для пом’якшення їжі) і перейти на нормальну тверду дієту через 5 днів.
Наша кишкова хірургія РО забезпечує живу модель гіпертрофії кишкової непрохідності, в якій клітини SMC, ICC та PDGFRα + аномально реконструюються. Ця модель PO також ідеально підходить для розуміння того, як кишкові нейрони модифікуються PO та як впливають основні рухові дії в тонкій і товстій кишці 23. Ці клітини можна динамічно реконструювати в патологічних умовах, а також в культивованих умовах 15, 16. Ми спостерігали, що ці клітини у SO-мишей поводились дещо інакше, ніж звичайні недіючі миші (рис.2 і малюнок 3). Кишкова непрохідність у більшості людей спричинена спайками живота, що розвинулися після операції, що призводить до гіпертрофії гладких м’язів 3, 4, 5, 21. Після операції з SO ми також виявили, що клітини SMC, ICC та PDGFRα + були дещо гіпертрофічними в кишечнику порівняно з NO (фігура 3), припускаючи, що сама операція може спричинити гіпертрофію гладких м’язів кишечника. Якщо це так, то операція не є повним негативним контролем для хірургічної операції. НІ, а також СО слід використовувати як порівняння з кишечником РО.
Підводячи підсумок, ми виявили економічно ефективний, надійний та повторюваний хірургічний протокол РО у мишей, що створює міцні кишкові непрохідності. Під час розвитку обструкції SMC, ICC, PDGFRα +, а також клітини нейронів динамічно переробляються в межах різних тканинних та місцевих шарів. Ця жива модель обструкції пропонує нові перспективи пізнання фенотипових змін, що відбуваються при кишкової непрохідності на клітинному рівні.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.