виникненню

  • предметів
  • реферат
  • цілі:
  • методи:
  • результати:
  • висновок:
  • вступ
  • Матеріали і методи
  • Суб'єкти та біопсія гастродуоденальної системи людини
  • звір
  • Статура
  • Пероральні тести на толерантність до глюкози
  • Біохімічні показники крові
  • Гістологічні та імуногістохімічні дослідження
  • У природніх умовах вплив лептину на рівнів мРНК Tph1 a Pax4
  • Кількісний аналіз ПЛР у режимі реального часу
  • Радіоімуноаналіз на лептин та інсулін
  • Вміст слизової оболонки дванадцятипалої кишки кишкових мишей LEPR-B KO 5HT ( IECLEPR-B KO)
  • Статистичний аналіз
  • результат
  • Підвищена експресія шлункового лептину у осіб із ожирінням
  • MRNA TPH1 a PAX4 збільшуються при антральних біопсіях осіб із ожирінням
  • Підвищений шлунковий лептин передує лептину в плазмі (вироблення адипоцитів) у мишей, що харчуються HFD
  • Номер і рівень комірки ЕС Pax4 ІРНК збільшувались у мишей до початку ожиріння
  • Рівні мРНК Pax4 зменшення дефіциту лептину та збільшення після перорального прийому лептину
  • обговорення

предметів

  • Стільникова сигналізація
  • Ожиріння
  • патогенез

реферат

цілі:

Що стосується ожиріння, тоді як гіперлептинемія сильно корелює з надлишком жиру, стан лептину шлунку залишається невідомим. Тут ми вивчили експресію лептину в шлункових біопсіях людей із ожирінням та проаналізували часові зміни експресії шлункового лептину у відповідь на ожиріння, спричинене дієтою, та його вплив на клітини, що продукують 5-гідрокситриптамін (5НТ).

методи:

Клітини ентерохромафіну (ЕК) та лептин, PAX4 (критичний фактор для специфікації ЕС), триптофан-гідроксилаза-1 (ТРН1, фермент, що обмежує швидкість периферичної клітини для 5НТ) та 5НТ досліджували за допомогою імунофлюоресценції, кількісної ПЛР у реальному часі, радіоімуноаналізу та біопсії шлунка. дванадцятипала кишка у 19 осіб із ожирінням та 14 осіб із нормальною вагою та у зіскрібках слизових оболонок від мишей із ожирінням, спричинених дієтою, C57B16/J, мишей із ожирінням, що страждають лептином, та мишей з дефіцитом ізоформи рецептора В до лептину.

результати:

Хоча гіперлептинемія у людей з ожирінням, а також на моделях ожиріння на тваринах корелює зі збільшенням жирової маси, що продукує лептин, статус лептину шлунку ще потрібно визначити. У цьому дослідженні ми спочатку вивчали експресію лептину у зразках біопсії шлунка у людей із ожирінням та не ожирінням, а потім аналізували часові зміни експресії шлункового лептину у мишей під час дієти з високим вмістом жиру (HFD).

У межах центральної нервової системи кілька досліджень повідомляють, що залежна від лептину 5-гідрокситриптамін (5HT; також відома як серотонін) регулювання апетиту, 22, 23, 24, в той час як інші повідомляють, що лептин не має прямого впливу на нейрони 5HT центральної нервової системи нейрони. нервова система впливає на апетит., 25, 26, 27

Оскільки більша частина 5HT (95%) в організмі виробляється клітиною ентерохромафіну (EC) в кишечнику (головним чином в антральній і дванадцятипалій кишці), а також тому, що 5HT, що отримується з кишечника, не проходить гематоенцефалічний бар’єр, і пропонується що 28 визначають, чи може існувати шлунковий лептиновий шлях - 5НТ. З цією метою під час розвитку ожиріння ми досліджували кількість клітин ЕС у слизовій оболонці антрального відділу, а також експресію триптофану гідроксилази-1 (TPH1), ферменту, що обмежує периферичну швидкість вироблення мРНК 5HT, 29 та Pax4, що є критичним транскрипція. коефіцієнт для специфікації комірок ЕС. 30

Матеріали і методи

Суб'єкти та біопсія гастродуоденальної системи людини

Через невелику кількість людей, що не страждають ожирінням, біопсію отримали у осіб із нормальною вагою, яким проводили ендоскопію для діагностики. Усі ці суб'єкти дали письмову інформовану згоду на верхню ендоскопію, і всі мали нормальну ендоскопію та нормальну слизову шлунка, підтверджені рутинним гістологічним аналізом. Під час ендоскопічного дослідження були взяті зразки біопсії з очного дна та антрального відділу шлунка та з дванадцятипалої кишки. Деякі використовували для класичного гістологічного дослідження, а інші негайно заморожували в азотній рідині і зберігали при -80 ° C до тих пір, поки не використали для виділення загальної РНК та білків.

Мишей C57BL/6J, об/об у віці 6-8 тижнів (Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle, Франція), розміщували в окремих клітках у клітинах для тварин (12:12 світло/темно, 21 ° C) з вільним доступ до води. Їх годували стандартною дієтою (нормальна дієта (ND), 2900 калорій г -1), що містить 3% жиру, 48% складних вуглеводів первинного крохмалю та 16% білка або HFD (4400 калорій г -1), що містить 45% жиру, 35% вуглеводи та 20% білка (C1090-45, Genestil, Altromin Royaucourt, Франція). Вимірювали споживання їжі та визначали масу тіла двічі на тиждень протягом 12 тижнів.

Статура

Нежирну масу та нежирну масу (що представляє воду та білки) визначали за допомогою подвійної енергії поглинання рентгенівських променів за допомогою приладу Piximus (GE Lunar Prodigy Corporation), як описано вище. 31 мишу досліджували до і після 1 та 12 тижнів від початку дієтичного втручання.

Пероральні тести на толерантність до глюкози

Миші голодували протягом 16 годин при пероральній дозі 2 г глюкози на кг маси тіла. Зразки крові хвоста крові оцінювали за допомогою глюкометра (Accu-Chek; Roche Diagnostics, Мейлан, Франція) до і через 15, 30, 60 і 120 хвилин після навантаження глюкозою, а площі під кривою (AUC 0-120 хвилин) розраховували .

Біохімічні показники крові

Через дванадцять тижнів після дієти мишам знеболювали; кров відбирали для визначення рівня глюкози, тригліцеридів, загального холестерину ліпопротеїдів загальної та високої щільності, аланінамінотрансферази та аспартатамінотрансферази. Ці параметри вимірювали за допомогою автоматизованого аналізатора AU400 (Olympus Diagnostics, Rungis, Франція). Рівень лептину та інсуліну в плазмі крові у мишей визначали за допомогою наборів для радіоімуноаналізу від Linco Research Inc. (Лабодія, Франція). Після вбивства шлунок та дванадцятипалу кишку видаляли та розділяли на дві частини: одну для відділів слизової оболонки, а іншу для гістології, імуногістохімії та імунофлюоресцентного аналізу.

Гістологічні та імуногістохімічні дослідження

Коротко, вкладені в парафін 10% нейтральні зафіксовані формаліном вихідні біопсії, тканини шлунку та дванадцятипалої кишки миші розділили на 5 мкм і використовували для рутинної гістології та імунореактивного фарбування, як описано раніше. 7 Після депарафінізації та гідратації зрізи попередньо обробляли 3% H 2 O 2 протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, а антитіла інкубували протягом ночі при 4 ° C у солі, забуференному фосфатом, що містить бичачий сироватковий альбумін). Для досліджень імунофлуоресценції серійні зрізи інкубували з кролячими 5HT антитілами (серотоніном), розведеними 1: 10000 (Immunostar, Hudson WI, США), та козячими анти-кролячими вторинними антитілами Alexa 488 Fluor IgG (молекулярні зонди; Invitrogen, Saint Aubin, Франція). Кількість 5НТ-позитивних клітин визначали кількісно, ​​підраховуючи принаймні п'ять добре орієнтованих антральних залоз (20x) на тварину (чотири тварини на групу) за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень Calopix (TRIBVN, Chatillon, Франція). Результати виражаються як кількість епітеліальних клітин на одну залозу.

Вплив лептину in vivo на рівні мРНК Tph1 та Pax4

Вісімнадцятигодинним голодним мишам вводили фізіологічний розчин, забуференний фосфатом (контроль), або 0,2 мкг лептину миші на г ваги тіла щодня протягом 7 днів. На 8 день їм знеболювали, збирали кров, центрифугували і зберігали плазму при -20 ° C. Мишей жертвували, шлунок і дванадцятипалу кишку відкривали, двічі промивали в сольовому розчині, забуференному фосфатом, а слизову бракували і негайно заморожували в рідині азоту. і зберігають при -80 ° C до використання для виділення загальної РНК для кількісного аналізу ПЛР у реальному часі.,

Кількісний аналіз ПЛР у режимі реального часу

Загальну РНК виділяли з біоптатів та слизової оболонки шлунка, дванадцятипалої кишки за допомогою реагенту Trizol (Invitrogen, Saint Aubin, Франція). Кількісну ПЛР у реальному часі проводили на системі Light Cycler 480 (діагностика Roche), як описано 32, з використанням конкретних праймерів: для миші Tph1 (NM_001276372.1), миші Pax4 (NM_001159925.1); людський PAX4 (NM_006193.2) та людський TPH1 (NM_004179.2), усі синтезовані Eurogentec (Анже, Франція). Дані аналізували, як описано раніше. 32

Радіоімуноаналіз на лептин та інсулін

Гомогенати готували із зразків заморожених основних біоптатів у Krebs-Ringer-HEPES (1 мг мл -1), що містять інгібітори протеази (Sigma Chemicals, Сент-Луїс, Міссурі, США) з тефлоновим гомогенізатором скла. Гомогенати центрифугували при 10000 g протягом 10 хвилин. Лептин визначали в гомогенатах тканин і плазмі за допомогою набору для радіоімуноаналізу людського лептину від Linco Research Inc. Кількісний інсулін у плазмі крові визначали за допомогою набору для радіоімунологічного аналізу інсуліну миші. 33

Вміст слизової оболонки дванадцятипалої кишки кишкових мишей LEPR-B KO 5HT (IEC LEPR-B KO)

Мишей дикого типу та IEC LEPR-B KO віком від 6 до 8 тижнів утримували у циклі 12:12: темне світло та забезпечували їжею та водою за бажанням. Мишей, які голодували протягом ночі, жертвували, а після лапаротомії дванадцятипалу кишку швидко видаляли, промивали холодною водою, а слизову відкидали відразу після заморожування в рідкому азоті і зберігали при -80 ° C до використання. фосфатний буферний сольовий розчин за допомогою скляного гомогенізатора на льоду. Гомогенати центрифугували при 5000 g протягом 10 хвилин. Супернатанти збирали і використовували для визначення 5HT за допомогою набору імуноферментних аналізів 5HT (Abnova Corporation, Тайвань).

Статистичний аналіз

Результати виражаються як середнє значення ± sem. Залежно від типів порівняння, непараметричний тест Манна-Уітні або односторонній дисперсійний аналіз з Тукі-Крамером проводили багаторазові порівняльні тести, використовуючи GraphPad Prism версії 5.00 для Windows, (GraphPad Software Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія, США ). Значення Р 20 у 34 пацієнтів із ожирінням із суттєво підвищеним лептином у плазмі крові (рис. 1в) та загальним вмістом греліну було використано як граничне значення для статистичної значущості, тоді як рівень циркулюючого PYY був значно знижений порівняно з худими особами. (дані не відображаються). У осіб із ожирінням рівні слизової оболонки фундалу мРНК LEP були в 5 разів підвищені, а білка лептину - у 2 рази вищими (Р

Шлунковий лептин збільшився у людей із ожирінням порівняно з бідними. Загальну РНК або білки витягували з фундаментальних біопсій кандидатів на баріатричну хірургію із ожирінням та бідних осіб та використовували для визначення рівня мРНК лептину ( a ) і білка ( b ). Рівні лептину, виробленого адипоцитами, тестували в крові тих самих людей ( c ). Рівні мРНК TPH1 ( d ) і PAX4 ( e ) при антральних біопсіях ожиріння та бідних осіб. Результати представлені у вигляді даних дисперсії із середнім значенням, Р визначали за допомогою непараметричного тесту Манна-Уітні.

Повнорозмірне зображення

MRNA TPH1 і PAX4 підвищені в антральних біопсіях осіб із ожирінням

Рівні мРНК TPH1 в біологічних біопсіях антральних відділів людей із ожирінням (рис. 1г) були вдвічі вищими (1, 75–2, 73, 95% довірчий інтервал (ДІ)) порівняно з (0,38–0,67, 95% ДІ);

Характеристика мишей, які харчуються нормальним харчуванням (НД) та раціоном з високим вмістом жиру (ХФД). Споживання калорій ( a ), збільшення ваги b ), глюкоза в плазмі ( c ), тригліцериди, d ) холестерин ( e ) і рівень холестерину ліпопротеїнів високої щільності ( f ) оцінювали у мишей, яких годували ND або HFD протягом 3 місяців. Дані виражаються як середнє значення ± sem або як поля та вуса. Значення Р визначали за допомогою двостороннього дисперсійного аналізу для порівняння часового ходу отриманої маси та тесту Манна-Уітні для решти даних. НС, незначна.

Повнорозмірне зображення

Раннє та супутнє підвищення рівня інсуліну в крові та лептину в шлунку до початку ожиріння. Інсулін у плазмі крові ( a ), шлунковий лептин ( b ), тілесний жир ( c ) і лептин у плазмі, що виробляється адипоцитами ( d ) визначали у мишей, яких годували ND або HFD протягом 7, 14, 28 та 92 днів. Дані виражаються як середнє значення ± sem, статистична значимість * P 20

Кількість клітин ЕС та рівні мРНК Pax4 зростали у мишей до початку ожиріння

Щоб вивчити, чи не змінюється вміст 5HT у шлунку та дванадцятипалій кишці за тим самим раннім збільшенням під час HFD, як і вміст лептину в шлунку, ми провели дослідження імунофлюоресценції з 5HT на антральних та дуоденальних зрізах у мишей, яких годували ND та HFD. Як показано на малюнку 4, кількість 5НТ-позитивних клітин була вищою в антральному відділі та дванадцятипалій кишці HFD-, ніж у клітинах мишей, яких годували ND. Більше того, збільшена кількість клітин ЕС (рис. 4b) була пов’язана із збільшенням рівня мРНК Pax4 в антралі (в 1,5 рази; P

Кількість клітин EC та рівні мРНК Pax4 зростали в антральному відділі мишей, що годували HFD, протягом 7 днів. ( a ) Репрезентативні мікрофотографії 5НТ-позитивних клітин (клітин ЕС) в антральному відділі мишей, яких годували ND (ліва панель) та HFD (права панель) протягом 7 днів. b ) Кількісне визначення клітин ES, виражене як кількість клітин ES на одну залозу. ( c ) Рівні мРНК Pax4 у слизовій оболонці антрального відділу та дванадцятипалої кишки мишей, яких годували ND та HFD протягом 7 днів. Результати були середніми ± sem, n = 4 мишей у кожній групі, і групи порівнювали за допомогою непараметричного тесту Манна-Уітні.

Повнорозмірне зображення

Рівні мРНК Pax4 знижують дефіцит лептину та збільшуються після перорального введення лептину

Щоб визначити, чи можуть зміни в рівнях Pax4 частково пов’язані зі змінами лептину, ми проаналізували рівні мРНК Pax4 в слизовій оболонці антрального відділу та дванадцятипалої кишки мишей, що страждають лептином. ob/ob миші продемонстрували значне зниження мРНК Pax4 (50%, P

Цікаво, що ми виявили, що рання надмірна експресія шлункового лептину, спричинена HFD, супроводжується підвищеною кількістю 5HT-вмісних клітин ЕС як на передній, так і на слизовій оболонці дванадцятипалої кишки. Ці дані узгоджуються з результатами, які показують, що миші, які харчуються західною дієтою, збільшили доступність 5НТ в тонкому кишечнику. У системі шлунково-кишкового тракту 5НТ здебільшого виробляється в епітеліальних клітинах ЕС, а також зустрічається в нейронах ентеральної нервової системи. 42 5HT, що виробляється на периферії, не потрапляє в мозок 29, що обмежує його біологічний вплив поза мозку, хоча деякі нейрони гіпоталамусу можуть бути доступними. У головному мозку, хоча роль 5HT у опосередкуванні впливу лептину на регуляцію енергетичного гомеостазу опосередковується 5HT, він широко вивчений, але його ефекти все ще суперечливі. 24, 26 Це питання ніколи не вирішувалось у шлунково-кишковому тракті, де виробляються як лептин, так і 5HT. Повідомлялося, що у мишей з відсутністю зворотного захоплення 5HT (SERT), які виявляють гіперлептинемію та значне збільшення загальних 5HT, 43, розвивається непереносимість глюкози, резистентність до інсуліну та ожиріння, незважаючи на зменшення споживання їжі. 44

У цьому звіті ми виявили, що у людей із ожирінням фермент, що обмежує периферичну швидкість 5HT, TPH1 та фактор транскрипції PAX4, підвищений. Pax4 є критичним для специфікації клітин EC, оскільки ці клітини повністю відсутні у мишей з дефіцитом Pax4. 30 Ми вважаємо, що лептиновий шлях відіграє певну роль у специфікації клітинної лінії ЕС, оскільки (i) кількість клітин EC зменшується в тонкому кишечнику мишей із ожирінням db/db з дефіцитом рецептора лептину, мишей з дефектом 45 (ii) в LEPR-B передача сигналів в епітеліальних клітинах кишечника має знижений вміст 5HT і (iii) пероральне лікування мишей лептином (імітуючи шлунковий лептин) збільшує Pax4 в антральній і дванадцятипалій кишці. Роль лептину в контролі диференціації клітин вже пропонується в ембріональних нейроепітеліальних клітинах, оскільки він підтримує нервові родоначальники та сприяє розвитку глії та нейронів в ембріонах. 46 Крім того, було показано, що лептин індукує експресію нейрогенін-1, -2 та NeuroD1/BETA 2, трьох факторів транскрипції bHLH, які також беруть участь у специфікації ентероендокринних клітин.

Зараз з’являються докази того, що вивільнення 5НТ клітинами ЕС у відповідь на поживні речовини у просвіті відіграє важливу роль у розвитку запалення кишечника. 47, 48, 49 Також визнано, що ожиріння пов'язане з хронічним запаленням низького ступеня. Нещодавно висловлювали припущення, що запалення кишечника може бути раннім наслідком СН, що сприяє ожирінню та пов'язаній з ним резистентності до інсуліну. Хоча механізми, що лежать в основі раннього запалення кишечника, пов’язаного з ожирінням, не до кінця визначені, вони чітко залучають мікробіотики кишечника. 51 Після передачі сигналів про лептин раннє підвищення рівня 5HT в кишечнику, яке спостерігається під час СНВ, може також сприяти індукції запалення кишечника та ожиріння; однак це все ще потрібно чітко продемонструвати.

Коротко кажучи, це перша демонстрація того, що шлунковий лептин підвищений в осіб із ожирінням і що надмірна експресія мала місце до настання ожиріння, до збільшення маси жиру та збільшення рівня лептину, що виробляється адипоцитами у мишей. З даних ми припускаємо, що регуляція шлункового лептину під час ожиріння, спричиненого HFD, може представляти механізм адаптації клітин епітелію кишечника до високих калорій, що може сприяти збільшенню жиру та ожирінню. Існування "лептину-5НТ" похідного кишкового тракту може погіршити ефект цієї висококалорійної дієти.