дефіциту

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Миші з дефіцитом LMP7 стійкі до ожиріння, спричиненого HFD
  • Миші з дефіцитом LMP7 стійкі до індукованих HFD метаболічних розладів
  • Дефіцит LMP7 не впливає на споживання їжі, рухову активність та енергетичні витрати
  • Дефіцит LMP7 зменшує всмоктування ліпідів
  • LMP7 у клітинах кісткового та некісткового мозку сприяє розвитку ожиріння
  • Дефіцит LMP7 полегшує запальні реакції в жировій тканині
  • обговорення
  • методи
  • звір
  • Мікро-КТ аналіз
  • Біохімічний тест
  • GTT та ITT
  • Гістологія та імуногістохімія
  • RT-PCR-аналіз у реальному часі
  • Експерименти з БМТ
  • Аналіз дихальних газів та опорно-рухового апарату
  • Збір фекалій та екстракція ліпідів у фекаліях
  • Аналіз проточної цитометрії
  • Експерименти в пробірці
  • Статистичний аналіз
  • Детальніше
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

  • Ендокринна система та метаболічні захворювання
  • Метаболічний синдром
  • Ожиріння

реферат

Ожиріння є основним фактором ризику інсулінорезистентності, гіперглікемії, дисліпідемії та гіпертонії, відомих як метаболічний синдром, і стало глобальною проблемою охорони здоров'я. Ці порушення обміну речовин підвищують ризик серцево-судинних захворювань та цукрового діабету 2 типу та сприяють збільшенню смертності та захворюваності. Хоча патогенез ожиріння є складним і включає різні фактори, останні дослідження показали, що запалення жирової тканини є ключовим патогенним фактором 1, 2. Насправді, інфільтрація макрофагів у жирову тканину спостерігається на тваринних моделях ожиріння, а також у людей із ожирінням у людей з метаболічним синдромом. Ці клітини є основним джерелом запальної продукції цитокінів/хемокінів, включаючи фактор некрозу пухлини α (TNF-α), інтерлейкін (IL) -1β та хемокіновий ліганд 2 мотиву CC (CCL2), також відомий як білок-хемоаттрактант моноцитів [1]. MCP-1].), Які, в свою чергу, отримують запальні клітини і надалі сприяють запаленню жирової тканини. Однак поки не зовсім зрозуміло, як відбувається запалення і що регулюється в патофізіології ожиріння.

результат

Миші з дефіцитом LMP7 стійкі до ожиріння, спричиненого HFD

Спочатку ми дослідили, чи може дефіцит LMP7 вплинути на розвиток ожиріння у мишей дикого типу (WT) та мишей LMP7 -/-, які годувались нормальним харчуванням або HFD протягом 8 тижнів. Хоча між мишами WT та LMP7 -/- на звичайній дієті не спостерігалося суттєвої різниці у збільшенні маси тіла, миші LMP7 -/- отримали значно меншу масу тіла, ніж миші WT на дієті з високим вмістом жиру (HFD) (рис. 1А Вага епідидимальної та підшкірної білої жирової тканини (WAT) різко зменшився у мишей LMP7 -/- порівняно з вагою у мишей WT (рис. 1B). Відносна вага (маса тканини/маса тіла) кожного WAT у мишей LMP7 -/- була нижчою, ніж у мишей WT (рис. 1C, печінка: зменшення на 15,9%, епідидима: 44,7%, брижа: 24,9%, периренал: 50,7 % та підшкірно: 47,3%). Зниження було гістологічно пов’язано зі зменшенням розміру адипоцитів у епідидимальній та підшкірній ВАТ (рис. 1D, Е). Аналіз комп’ютерної томографії (КТ) показав менший вага вісцерального та підшкірного жиру у мишей LMP7 -/-, ніж у мишей WT (рис. 1F, G). Ці результати свідчать про те, що дефіцит LMP7 захищений від ожиріння, спричиненого ВЧР.

( А - С ) TCHO в сироватці крові, рівні TG ( A ), глюкоза в крові ( B ) та сироватковий інсулін ( C. ) у мишей WT та LMP7 -/- на нормальній дієті та HFD (n = 8–12). ( D, E ) Результати GTT ( D ) та ITT ( Е ) у мишей WT та LMP7 -/- на нормальній дієті та HFD (n = 8 для кожної). Дані виражаються як середнє значення ± SEM. * p -/- або на звичайній дієті, або на HFD (рис. 3А), ми вимірювали рухову активність та витрати енергії в обох штамах, щоб оцінити різницю в базальних показниках метаболізму. Істотних відмінностей у руховій активності, споживанні кисню (VO 2), швидкості дихального обміну (RER), споживанні вуглеводів (CH) та споживанні жиру (FAT) між мишами WT та LMP7 -/- на нормальній дієті або HFD дієті не виявлено . (Рис. 3B, C). На підтримку цього результату, хоча експресія Ucp1 (незв’язуючого білка 1 або термогеніну) в жировій тканині коричневого кольору була збільшена внаслідок годування HFD, не було суттєвої різниці в експресії між мишами WT та LMP7 -/- (дані не наведені).

( A ) Споживання їжі у мишей із WT та LMP7 -/- на нормальній дієті (n = 7–8) та HFD (n = 13–14). ( B ) Рухова активність у мишей WT та LMP7 -/- на нормальній дієті та HFD (n = 8 для кожного). C. Дані про витрати енергії. VO 2, RER, CH та FAT у мишей WT та LMP7 -/- на нормальній дієті та HFD (n = 8 для кожного). Дані виражаються як середнє значення ± SEM.

Повнорозмірне зображення

Дефіцит LMP7 зменшує всмоктування ліпідів

Щоб вивчити протизапальний ефект дефіциту LMP7 у ВАТ, ми нарешті оцінили, чи беруть участь у цьому процесі адипонектин та лептин. Рівні адипонектину в сироватці крові були значно вищими у мишей LMP7 -/-, що годувались HMPD, порівняно з мишами WT, що годувались HFD (рис. 6G). Відповідно, експресія Adipoq, що кодує адипонектин, також регулювалася в епідидимальній WAT мишей LMP7 -/- (Додаткова фігура S3). Відомо, що фактори транскрипції, кодовані Pparg (активований проліфератором пероксизоми рецептор γ), Cebpa (CCAAT/енхансер-зв'язуючий білок [C/EBP] -α) та Cebpb (C/EBP-β), можуть бути індуковані експресією Adipoq 12, 13. Експресія всіх цих факторів транскрипції була значно збільшена у мишей LMP7 -/- порівняно з мишами WT (додаткова фігура S3). Рівні лептину в сироватці крові суттєво підвищувались у мишей WT, яких годували HFD, і ці рівні значно знижувались у мишей LMP7 -/-, які годували HFD (рис. 6H). Ці результати свідчать про те, що адипонектин і лептин були залучені до зменшення запалення жирової тканини та метаболічних розладів у мишей LMP7 - /. - .

обговорення

Основні висновки цього дослідження такі: (1) дефіцит LMP7 зменшив накопичення жиру, спричиненого HFD, і був захищений від ожиріння; (2) Дефіцит LMP7 покращив непереносимість глюкози та чутливість до інсуліну, а також покращив метаболізм ліпідів та глюкози (3) не було різниці у споживанні їжі, руховій активності та енергетичних витратах між мишами WT та/або LMP7; (4) Дефіцит LMP7 зменшує всмоктування ліпідів; (5) Експерименти BMT показали, що LMP7 як у клітинах, що походять з кісткового мозку, так і в клітинах, отриманих з кісткового мозку, сприяв розвитку ожиріння, спричиненого HFD; (6) Дефіцит ЛМП зменшував запальні реакції, такі як інфільтрація макрофагів та експресія хемокінів, одночасно збільшуючи продукцію адипонекції. Результати цього дослідження свідчать про те, що LMP7 сприяє запальній реакції жирової тканини на макрофагах та розвитку ожиріння та метаболічних порушень. Наскільки нам відомо, це дослідження дає перші докази того, що LMP7 відіграє важливу роль у розвитку ожиріння та порушення обміну речовин.

З'являється все більше доказів того, що запалення відіграє важливу роль у розвитку ожиріння та порушення обміну речовин. 1, 2. Хоча існує багато звітів, що описують роль запалення в їх процесі, не зовсім зрозуміло, як відбувається запалення та як воно регулюється. Хоча відомо, що імунопротеасома відіграє важливу роль у презентації антигену класу МНС класу I, останні дослідження показали, що LMP7 необхідний для продукування прозапальних цитокінів, таких як TNF-α та IL-6, та для прогресування експериментальних артрит та коліт 5, 6. У цьому дослідженні ми продемонстрували, що дефіцит LMP7 пригнічує запалення жирової тканини, ожиріння та порушення обміну речовин: це свідчить про те, що інгібування LMP7 може запобігати та лікувати ожиріння та порушення обміну речовин. Дійсно, кілька експериментальних досліджень вказують на те, що селективний інгібітор LMP7 ONX-0914 є високоефективним у лікуванні експериментального артриту та коліту 5, 6. Тому вплив цього інгібітора LMP7 на ожиріння та порушення обміну речовин необхідно досліджувати в майбутніх дослідженнях.

Ми показали, що дефіцит LMP7 зменшує експресію ліпаз підшлункової залози, підвищує вміст ліпідів у стільці та інгібує збільшення рівня ТГ у плазмі крові після перорального прийому олії або HFD. З іншого боку, рівень глюкози та інсуліну в сироватці крові у мишей LMP7 -/- не впливав на нормальну дієту. Миші LMP7 -/- покращували непереносимість глюкози та чутливість до інсуліну. Таким чином, LMP7 впливає на зовнішню та внутрішню секреторну функцію підшлункової залози і бере участь у травленні та гормональному гомеостазі, що має важливе значення в метаболічному стані мишей.

На закінчення ми чітко показали, що дефіцит LMP7 інгібує індуковане макрофагами запалення в жировій тканині та покращує розвиток ожиріння та метаболічних порушень у мишей, що харчуються HFD. Грунтуючись на наших висновках, ми припускаємо, що дефіцит LMP7 пригнічує запалення жирової тканини, інгібуючи індукцію прозапальної цитокіни в макрофагах та адипонекуляцію, що виробляється адипоцитами. Крім того, LMP7 впливає на зовнішню та внутрішню секреторну функцію підшлункової залози. Це дослідження не тільки демонструє, що LMP7 може бути потенційною терапевтичною мішенню для профілактики та лікування ожиріння та метаболічних розладів, але також дає нові уявлення про механізм, що лежить в основі патофізіології цих розладів.

методи

Всі експерименти на тваринах були схвалені Комітетом з використання та догляду за експериментальними тваринами Керівництва з лабораторних тварин лабораторії медичного університету Джічі та проводились відповідно до керівних принципів медичного університету Джічі. Мишей C57BL/6J WT було придбано у Japan SLC, Inc. (Хамамацу, Японія). Миші LMP7 -/- були описані раніше 4. Самців мишей (віком від 9 до 10 тижнів) годували або 60 ккал% HFD (дослідницькі дієти: D12492, Японія LSG, Токіо), або звичайною чау (CE-2; CLEA Japan Inc., Осака). Кожну мишу зважували кожні 2 тижні. У кінцевих точках мишей голодували протягом 6 годин, повторно зважували і кровоточили для отримання сироватки. Після перфузії тканини ретельно вирізали і зважували.

Мікро-КТ аналіз

Мікро-КТ-аналіз проводили за допомогою LaTheta LCT-200 (Hitachi Aloka Medical, Токіо, Японія). М’язову, вісцеральну та підшкірну жирову масу аналізували за допомогою програмного забезпечення LaTheta (Hitachi Aloka Medical).

Біохімічний тест

Кров відбирали з хвостової вени 6 годин голодуючих мишей. Рівні глюкози в крові вимірювали за допомогою глюкометра Terumo MEDISAFE® (Terumo Co., Токіо, Японія). Рівні TCHO та TG у сироватці або плазмі крові вимірювали за допомогою системи FUJI DRI-CHEM (Fujifilm, Токіо, Японія). Рівні інсуліну в сироватці крові, адипонектину та лептину вимірювали за допомогою наборів ELISA (Sibayagi, Gunma, Японія; R&D Systems Inc., Міннеаполіс, Міннесота; та BioVendor R&D, Брно, Чеська Республіка).

GTT та ITT

GTT проводили мишам на стандартній дієті або HFD протягом 8 тижнів. Миші голодували за 6 годин наперед, маючи вільний доступ до води. Потім вимірювали рівень глюкози в крові безпосередньо перед внутрішньочеревною ін’єкцією глюкози (1 г/кг маси тіла у фізіологічному розчині) та через 15, 30, 60, 90 та 120 хвилин після введення. ITT проводили подібним чином, вводячи інсулін (0,75 ОД/кг маси тіла) замість глюкози.

Гістологія та імуногістохімія

Фарбування ВІН та імуногістохімія для F4/80 та LMP7 проводили, як описано раніше в 4, 23 .

RT-PCR-аналіз у реальному часі

Загальну РНК готували з нирок із застосуванням ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd., Тояма, Японія) відповідно до інструкцій виробника. RT-PCR-аналіз у реальному часі проводили за допомогою системи виявлення теплового циклу куба PCR Takara TP960 (Takara Bio Inc, Шига, Японія) для виявлення експресії мРНК, як описано раніше 23. Експресія генів нормалізувалась експресією Actb (β-актину) за допомогою програмного забезпечення, що постачається разом із системою. Праймери, що використовуються для аналізу RT-PCR, перелічені в додатковій таблиці S1.

Експерименти з БМТ

Мишей BMT генерували, як описано раніше 24. Ми використовували мишей зеленого флуоресцентного білка (GFP) як донорів для перевірки відновлення кісткового мозку після трансплантації за цим протоколом. Аналіз проточної цитометрії показав, що через 8 тижнів після ВМТ клітини периферичної крові складалися з більш ніж 90% GFP-позитивних клітин 24. За допомогою цього протоколу ми створили 3 типи мишей BMT: WT → WT, LMP7 -/- → WT, WT → LMP7 -/- миші).

Аналіз дихальних газів та опорно-рухового апарату

Мишей індивідуально поміщали в метаболічну камеру на 48 годин, щоб дозволити їм адаптуватися до навколишнього середовища та досягти постійної швидкості дихального обміну (RER). Аналіз дихальних газів (O 2 і CO 2) проводили за допомогою системи аналізу метаболічних газів у відкритому контурі, підключеної безпосередньо до мас-спектрометра (Arco2000; ArcoSystem, Chiba, Японія). Витрати кисню (VO 2) та вироблення діоксиду вуглецю (VCO 2) вимірювали кожні 5 хвилин для кожної клітки (одна миша). RER розраховували як співвідношення VCO2/V02. Загальне споживання вуглеводнів (CH) та споживання жиру (FAT) обчислювались за допомогою стехіометричних рівнянь Фрейна наступним чином: CH = 4,51 × VCO 2 - 3, 18 × V02 [мг/хв] та FAT = 1,67 × (V02 - VCO) 2) [мг/хв]. Рухову активність визначали кожні 5 хвилин для кожної камери (одна миша) за кількістю інфрачервоних променів, порушених в обох напрямках X та Y, за допомогою системи контролю активності (ACTIMO-100; Shinfactory, Фукуока, Японія) у поєднанні з окремими метаболічними камерами.

Збір фекалій та екстракція ліпідів у фекаліях

Окремі випорожнення мишей, що годували HFD, збирали протягом 24 годин і сушили вакуумним центрифугуванням. Висушені фекалії зважували і подрібнювали в ступці. Розмелений кал переносили в скляну трубку і знову зважували. Ліпіди двічі екстрагували хлороформом: метанолом (2: 1) за методом Фолча 25 і зважували. Вміст ліпідів розраховували як% від маси меленого калу.

Аналіз проточної цитометрії

Інфільтруючі лейкоцити в епідидимальній ВАТ аналізували за допомогою проточної цитометрії, як описано раніше 11. Дані проточної цитометрії отримували за допомогою FACSVerse (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія) та аналізували за допомогою програмного забезпечення FlowJo (Treestar, Inc., San Carlos, CA). Реагенти, що використовуються для аналізу проточної цитометрії, перелічені в додатковій таблиці S2.

Експерименти in vitro

Перитонеальні макрофаги миші культивували в RPMI1640 (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі), доповнену 10% плодовою бичачою сироваткою (FBS) та 1% антибіотиком-антимікотиком (Invitrogen, Carlsbad, CA), використовуючи 24-лункові планшети. Через 48 год клітини стимулювали 400 мкМ пальмітату (10% BSA) 26 протягом 24 год. Рівні IL-1β, IL-6 та TNF-α у супернатантах визначали за допомогою наборів ELISA (R&D Systems Inc.).

Статистичний аналіз

Результати з нормальним розподілом аналізували параметричним неспареним t -тестом. Результати без нормального розподілу аналізували за допомогою критерію Манна - Уітні, критерію Крускала - Уолліса або поздовжнього аналізу. Всі аналізи проводились із використанням програмного забезпечення Stata, випуск 13 (Stata Corp., College Station, TX). P -значення