Резюме
Швидкий розвиток невеликих розмірів і прозорості даніо є великими перевагами для вивчення вродженого імунного контролю інфекції 1-4. Тут ми продемонстрували методи зараження личинок даніо рибками патогенним грибом Candida albicans Шляхом мікроін’єкції, методологія, нещодавно використана для визначення активності фагоцитів оксидази NADPH у контролі диморфізму грибів 5 .
Анотація
Дисемінований кандидоз, спричинений збудником Candida albicans, є клінічно важливою проблемою у госпіталізованих осіб та пов’язаний із смертністю 30–40% 6. Системний кандидоз, як правило, контролюється вродженим імунітетом та людьми з генетичними дефектами вроджених імунних клітинних компонентів такі як фагоцитарна НАДФН-оксидаза, більш сприйнятливі до кандидемії 7-9. Дуже мало відомо про динаміку взаємодії C. albicans з імунними клітинами in vivo. Широкі дослідження in vitro показали, що поза хазяїном C. albicans проростає в макрофагах і швидко руйнується нейтрофілами 10-14. Дослідження in vitro, хоча і корисні, не можуть узагальнити комплекс в середовищі проживання, що включає динаміку рівня цитокінів, залежність від часу, прикріплення позаклітинного матриксу та міжклітинні контакти 10, 15-18. Щоб дослідити внесок цих факторів у взаємодію з господарем-патогеном, критично важливо знайти модельний організм, який би неінвазивно візуалізував ці аспекти інфекції в інтактному живому господарі.
Личинки даніо пропонують унікального та універсального господаря хребетних для вивчення інфекції. Протягом перших 30 днів розвитку личинки даніо мають лише вроджений імунний захист 2, 19-21, що спрощує вивчення таких захворювань, як дисемінований кандидоз, які сильно залежать від вродженого імунітету. Невеликі розміри та прозорість личинок даніо дозволять зобразити динаміку зараження на клітинному рівні як для господаря, так і для збудника. Трансгенні флуоресцентні імунні клітини личинок можуть бути використані для ідентифікації конкретних типів клітин, що беруть участь в інфекції 22-24. Модифіковані антисмислові олігонуклеотиди (Морфолінос) можуть бути використані для збиття різних імунних компонентів, таких як фагоцитна НАДФН-оксидаза, та вивчення змін у відповідь на грибкову інфекцію 5. На додаток до практичних та етичних переваг використання невеликого нижнього хребетного, личинки риб Зебра пропонує: унікальна можливість зобразити битву між патогеном та господарем як в житті, так і в кольорі.
Риба-даніо використовувалася для моделювання зараження ряду патогенних бактерій людини і сприяла важливим досягненням у нашому розумінні мікобактеріальної інфекції 3, 25. Однак лише нещодавно набагато більші збудники, такі як гриби, використовувались для зараження личинок 5, 23, 26, і на сьогоднішній день не існує детального візуального опису методології зараження. Тут ми представляємо наші технології мікроін’єкції заднього мозку шлуночків Prim 25, включаючи наші модифікації попередніх протоколів. Наші результати з моделлю личинок даніо для грибкової інфекції відрізняються від досліджень in vitro і підсилюють необхідність вивчення взаємодії хазяїн-збудник у складному машинному середовищі, а не в спрощеній системі чашки Петрі 5.
Протокол
Всі протоколи та експерименти по догляду за даніо проводились згідно з протоколом інституційного догляду та зайнятості тварин (IACUC) A2009-11-01.
1. Морфоліно та ін’єкційні страви з личинок
Тривалість експерименту: * (10-15 хвилин)
Ступінь складності: *
- Для ін’єкцій яєць готуйте 2% розчин агарози у стерильній воді та мікрохвильовій печі. Коли розчин охолоне, вилийте трохи його в надзвичайно глибоку чашку Петрі (Fisher Scientific) до повного наповнення. Остудіть лід і зробіть тарілку рівною.
- Після того, як пластина охолоне, заливається верхній шар 2 мл 2% агарози. Розпиліть ребристу пластикову форму для ін’єкцій яєць (Adaptive Tools of Science) стерильною водою з пульверизатора. Обережно помістіть отвір стороною вниз у гарячу форму з агарози. Коли агароза охолоне, використовуйте плоский металевий шпатель (VWR Scientific), щоб відмежувати шаблон від піднятого AGA. Поступово знімайте сітку з агарози. Оберніть посуд для ін'єкцій ембріонів у Parafilm (VWR Scientific) і зберігайте перевернутим при 4 ° C.
- Для ін’єкцій личинок риб готуйте 2% розчин агарози, як описано. Розлийте розчин у чашку Петрі стандартного розміру (VWR Scientific) і відставте до твердого стану. Загорніть пластини личинок та намету для ін’єкцій Парафільму, перевернутих при 4 ° C.
2. Підготовка грибної культури
Тривалість експерименту: ** (30 хвилин)
Ступінь складності: **
3. Інфекції даніо
Тривалість експерименту: **** (1-3 години)
Ступінь складності: ****
4. Підготовка риби на зображенні
Тривалість експерименту: ** (30 хвилин)
Ступінь складності: **
- Приготуйте розчин метансульфонату трикаїну, як і раніше (200 мг/мл). Виведіть заражену рибу та переведіть її на трикаїн.
- Приготуйте 47,9 мл 0,4% агарози з низькою температурою плавлення (VWR Scientific) в яйці та воді. Нагрійте розчин у мікрохвильовці. Охолодити до 37 ° C і до суміші додавати трикаїнметансульфонат (200 мг/мл)
- Після того, як риба іммобілізована в трикаїнметансульфонаті, піпетуйте окрему рибу в чашку Петрі (VWR Scientific), що містить 0,4% низькоплавкої агарози (VWR Scientific).
- Потім перемістіть рибу агарози з низьким розплавом в окремі лунки скляної нижньої пластини (MatTek Corporation) для візуалізації. Використовуйте якомога менше агарози з низьким розплавом, щоб риба лежала рівно на дні капсули. Використовуйте лише трикаїн-агарозу достатньо для заповнення еннерних кіл на нижній скляній пластині.
5. Модифікації, пов’язані з протоколами Юпітера
Мікропіпетки для мікроін'єкції
Тривалість експерименту: * (10-15 хвилин)
Ступінь складності: *
- Витягніть порожнисті скляні стержні BF120-69-10 (Sutter Instruments) з полум'яним коричневим витяжкою мікропіпетки Модель P-97 (Sutter Instruments) згідно Yuan et al. 30. Оберіть програму №7 з наступними умовами нагрівання = 470, швидкість = 120, час = 200. Отримана голка має 8 мм від фаски до кінчика, і після того, як відріжете 3 мм над кінчиком, у вас буде діаметр близько 10 мкм.
- Навантажте скляну мікропіпетку на тримачі. Виберіть "Витягнути". Нагрівальна нитка нагрівається до голки відповідно до параметрів програми, а скляний стрижень розділяється на дві витягнуті мікропіпетки. Мікропіпетки зберігають у коробці для зберігання піпеток (інструменти Саттера).
Збір ембріонів, ін’єкція Морфоліно та підтримка
Тривалість експерименту: *** (1-2 години)
Ступінь складності: ***
Тривалість експерименту: ***** (1-5 годин)
Ступінь складності: ***
6. Репрезентативні результати
Приклад успішного ромбенцефалонового шлуночка C. albicans у личинки даніо через 5 годин після зараження (HPI) та HPI 24 наведено у (Фігура 1). Як клітини макрофагів, що обволікають C. albicans, видно в задньому шлуночку мозку при 5 hpi. При 24 hpi C. albicans виявляється в клітинах макрофагів у спинній тканині хвоста, що свідчить про дисемінований кандидоз. Цей результат зараження сильно залежить від точного введення 10-15 дріжджів форми C. albicans у задній шлуночок мозку. Це може забезпечити скринінг зараженої риби відразу після ін’єкції.
Фігура 1 FLI1 трансгенні:. EGFP 22, 33 личинки, інфіковані CaF2-yCherry Candida albicans і інтравально зображені за допомогою конфокальної мікроскопії. (CA) через 5 годин після зараження (A) інфіковані EGFP личинки-експресійні клітини макрофагів у місці зараження (шлуночок ромбенцефалона) Шкала шкали = 100 мкм. (B і C) Зображення тієї ж риби із більшим збільшенням, що показують C. albicans, у фагоцитах. Шкала шкали = 100 мкм для В і 10 мкм для С. (DF) через 24 години після зараження (D) личинка, інфікована дисемінованим кандидозом CaF2-yCherry C. albicans усередині EGFP-макрофагоподібних клітин у спинному хвості тканини. Шкала шкал = 100 мкм. (E та F) Збільшення зображення тієї ж риби, що показує C. albicans у тканині хвоста. Шкала шкал = 100 мкм.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Представлений тут спосіб мікроін’єкції даніо відрізняється від Gutzman et al. 34, в якому тут продемонстровано введення через задній шлуночок мозку 36–48 личинок HPF через задній шлуночок мозку. Опис методу послідовного введення 10-15 дріжджів у ромбенцефалоновий шлуночок зі зменшеним пошкодженням тканин. Цей протокол виробляє місцеву інфекцію, яка спочатку поширюється по всьому тілу за 24 hpi. (Фігура 1) та результати значної летальності/захворюваності 5. Задній шлуночок мозку не повністю закритий до 48 HPF 27, 29. На цій першій стадії розвитку макрофаги та нейтрофіли мігрують до місця зараження, вони фагоцитують C. albicans і може переходити в інші частини тіла 5.
Справжня сила цієї системи походить від здатності поєднувати трансгенних даніо з флуоресцентним білком, що експресує мікроби. Ми розробили плями дикого типу та мутантів з C. albicans для конститутивної експресії mCherry, dTomato та eqFP650. Поєднання цих експресійних конструкцій з промоторами реакції на окислювальний стрес дозволяє проводити радіометричну кількісну оцінку окисного стресу у живих личинок даніо 5. Подвійне зображення in vivo флуоресцентних грибів та флуоресцентних вроджених імунних клітин у контексті мутанта гриба або риби-морфанта також може бути використано кількісно оцінити стійко змінені імунні реакції, такі як міграція до місця зараження, фагоцитоз збудника, запобігання проростанню грибків та вбивство п’яти.
На сьогоднішній день личинки даніо використовувались для моделювання вродженої імунної відповіді на бактеріальні патогени, грибки та віруси 5, 26, 35-46. Ці новаторські дослідження встановили корисність цієї модельної системи для відкриття нових клітинних та молекулярних механізмів як у хазяїна, так і у збудника. У поєднанні з цим описаним протоколом ці інші опубліковані статті служать основою для інших лабораторій для вивчення взаємодії хазяїн-грибок у контексті неушкодженого господаря.
Хоча описана тут трансгенна лінія FLI1: EGFP, хоча і корисна в цих експериментах, має свої обмеження. Ген FLI1 експресується в ендотеліальній судинці, на додаток до клітин макрофагів 22. Часто флуоресценція судинного EGFP може ускладнити виявлення C. albicans у клітинах макрофагів. Крім того, експресія EGFP в клітинах макрофагів зменшується приблизно через 18-24 години після зараження, що ускладнює виявлення. Нещодавно конкретні лінійні макрофаги були опубліковані у трансгенних даніо і мають багато переваг як модель для досліджень макрофагів 23.
Описана методика зараження забезпечує точку доступу до ряду потужних засобів генетичної та флуоресцентної мікроскопії, доступних у даніо. Його можна поєднувати з відповідними трансгенними рибами та штучними C. albicans, щоб забезпечити кількісну оцінку багатьох аспектів взаємодії хазяїн-збудник, включаючи кількість нейтрофілів та макрофагів, що містять C. albicans, частоту перетравлення C. albicans та поділ C 5. albicans, в імунних клітинах 5. Цей протокол також може поєднуватися із застосуванням морфолінових антисмислових олігонуклеотидів для перевірки ролі кожного з вроджених імунних генів в інфекції за допомогою.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Розкриття інформації
Конфліктів інтересів не заявлено.
Подяка
Автори висловлюють подяку лабораторії доктора Керол Кім за навчання мікроін'єкцій, Клариси Генрі за поради щодо прискорення розвитку ембріонів та використання наборів та Натана Лоусона за внесок у рибу FLI1: EGFP. Ми вдячні членам лабораторії Вілеру та Шону Паредесу за критичне прочитання рукопису. Ми також хотіли б подякувати Марку Нілану за догляд та поради за рибою, а Райану Феніці та Габору Крістіні за технічні поради щодо цього проекту. Ця робота була підтримана науковою асистентською програмою MAFES для братів К., грантом MAFES Hatch E08913-08 та премією NIH CNRR P20RR016463 Р. Вілеру.