- предметів
- реферат
- вступ
- результат
- Агенти інсулінової сигналізації в тканині лівого шлуночка
- Медіатори гіпертрофії лівого шлуночка (ЛШ) та стресу
- Експресія стероїдних рецепторів
- Результати гістології
- обговорення
- Матеріал і методи
- Виділення РНК та полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу
- Вестерн-клякса
- Гістопатологічний аналіз
- гістоморфометрія
- Статистичний аналіз
- Детальніше
- Додаткова інформація
- Документи Word
- Додаткова інформація
- Коментарі
предметів
- Серцево-судинна біологія
- Модель хвороби
реферат
У серцевій гіпертрофії 23, 24 було залучено кілька молекулярних медіаторів, що беруть участь в передачі сигналів інсуліну, таких як фосфатидил інозитол-3-кіназа (PI3K)/протеїнкіназа B (AKT)/ссавці-мішень сигнального шляху 1 комплексу рапаміцину (mTORC1). Дані досліджень in vitro 25 свідчать про те, що Т ініціює гіпертрофію серця, активуючи шлях mTORC1. Оскільки пренатальний Т індукує функціональну гіперандрогенію та резистентність до інсуліну у овець 4, 18, змінює сигналізацію про інсулін у печінці та м’язах 26, і як Т, так і інсулін мають потенціал змінити серцеву функцію, ми припустили, що пренатальний надлишок Т також порушує передачу сигналів інсуліну та збільшує інсулін регуляція інсуліну. молекулярні маркери гіпертрофії серця, що призводять до несприятливого ремоделювання серця.
результат
Вага тіла (кг; середнє значення ± SEM) не відрізнялося між контрольними та Т-обробленими вівцями під час збору (Т-обробленими 69, 4 ± 5, 4 проти контрольних 63, 09 ± 4, 9 р = 0,40, когезія d = 0, 44). Рівень інсуліну натще (МО/мл; середнє значення ± СЕМ) у жінок, які отримували пренатальний Т, як правило, був вищим (Т, які отримували 15, 7 ± 4, 7 порівняно з контролем 9, 23 ± 2, 12, р = 0,26), з Коеном аналіз виявив незначне збільшення (d) = 0,65). Рівень глюкози натще (мг/дл; середнє значення ± СЕМ) у середньому становив 58 ± 3, 9 та 52 ± 1,7 для жінок, які отримували Т, та контрольних осіб, відповідно (р = 0,28), при цьому аналіз Коенса виявив незначну різницю в розмірі. d = 0,67)., Відношення інсуліну до глюкози також, як правило, було вищим у групі, яка отримувала Т-препарат (0,25 ± 0,06), порівняно з контрольною групою (0,17 ± 0,04), при цьому аналізи Коена показали незначне збільшення (d = 0,60) . Вага лівого шлуночка у жінок, які отримували Т, як правило, був вищим, але статистично не відрізнявся від контрольних овець (Т, які отримували 164, 9 ± 9, 9 г проти контролю 152 ± 7,2 г, р = 0,30, когезія d = 0, 54).
Агенти інсулінової сигналізації в тканині лівого шлуночка
Значне збільшення експресії генів білків, що беруть участь у сигнальному шляху інсуліну, було виявлено у лівому шлуночку у жінок, які отримували пренатальний Т, порівняно з контролем. Пренатальний надлишок Т збільшив рівень експресії IRS-1 6, 4 рази (p = 0,027), PI3K у 8,5 рази (p = 0,04) та AKT у 27 разів (p = 0,06) порівняно з контролем (рис. 1 ).
Дві хвостові t-тести були використані для тестування відмінностей між Т-обробленою та контрольною групами, і * p було призначено ap # 0,06. Аналіз розміру ефекту Коена виявив великі відмінності між Т-обробленою та контрольною групами щодо генів, що беруть участь в передачі сигналів інсуліну . смуги (d Коена: AKT = 1,11, IRS-1 = 1,33, PI3K = 1,29, GSK3b = 0,452). Абревіатури: IRS-1 субстрат рецептора інсуліну 1, PI3K фосфоїнозитид 3-кіназа, Akt протеїнкіназа B, GSK3B Глікогенсинтаза кіназа 3 бета.
Повнорозмірне зображення
За базових умов експресія білка PI3K (субодиниця p85) у лівому шлуночку достовірно відрізнялася (p = 0,01) між пренатально обробленою Т (0,023 ± 0,01) та контрольною жінкою (0,019 ± 0,001); і pPI3K також збільшився (p = 0,018) у пренатально обробленому Т (0,01 ± 0,005) порівняно з контролем (0,008 ± 0,006). Співвідношення pPI3K/PI3K не було статистично значущим між групами (пренатальне лікування T: 0,5 ± 0,03 проти контролю: 0,45 ± 0,05, p = 0,55). Загальний АКТ (пренатальний T: 0, 40 ± 0, 03 проти контролю 0, 26 ± 0, 02; p = 0, 007) та pAKT (пренатальний T: 0, 26 ± 0, 03 проти контролю: 0, 18 ± 0 .02; р = 0,028) були значно збільшені у жінок, які отримували пренатальну терапію, порівняно з контролем. Співвідношення pAKT/AKT (пренатальне лікування Т: 0,65 ± 0,05; проти контролю: 0,69 ± 0,04) статистично не відрізнялося між двома групами (p = 0,57). Ми не побачили жодної різниці в рівнях білка транспортера глюкози 4 (GLUT 4) між пренатальним Т-лікуванням та контролем (р = 0,33, рис. 2).
Для тестування на різницю між обробленими Т та контрольними зразками використовували подвійний t-тест Стьюдента і * p призначали 25, 27 Т in vitro, виявлених у лівому шлуночку у жінок, які отримували пренатальну терапію Т, порівняно з контролем ( p = 0,002). (рис. 3) та експресія його білка також була збільшена в лівому шлуночку (загальний mTOR: пренатальний T 0, 16 ± 0,02 проти контролю 0,11 ± 0,01, p = 0,04; p mTOR: пренатальний T: 0,09 ± 0,008 проти контролю 0,056 ± 0,004; р = 0,01) (рис. 4). GSK3β, важлива мішень АКТ у серці, що сприяє пригніченню гіпертрофічного росту 28, відрізнявся між двома групами. Загальний рівень бета-тесту GSK3 був суттєво збільшений (р = 0,04) у жінок, які отримували пренатальне лікування (6,1 ± 0,57), порівняно з контролем (4,5 ± 0,4); тоді як p-GSK3 бета не відрізнявся (p = 0, 16) між пренатально обробленою Т (1,99 ± 0,22) та контрольною (1,56 ± 0,15) групами. Співвідношення p-GSK 3 бета/GSK3beta було значно нижчим (p = 0,002) у жінок, які отримували пренатальну терапію Т (0,32 ± 0,008), порівняно з контролем (0,35 ± 0,05) (рис. 4).
Два хвостових t-тести a * при p # для р 0,06 були використані для тестування різниці між групами, які отримували Т і контрольну групу. Аналіз розміру ефекту Коена виявив помірну та велику різницю між обробленими Т та контрольними групами для генів, що беруть участь у сигнальних шляхів. інсулін (d Коена: mTORC1 = 1,89, aMHC = 1, 20, ßMHC = 0, 89, mTORC1 = 1, 89, BNP = 1, 34, ANP = 0, 61, NFATc3 = 1, 46). Скорочення: mTORC1 Ссавці-мішень комплексу рапаміцину 1, важкий ланцюг міозину MHC, природний пептид головного мозку BNP, природний пептид ANP, природні Т-клітини, активовані ядерним фактором NFATc3.
Повнорозмірне зображення
Для тестування різниці між обробленими Т та контрольними зразками використовували подвійний t-тест Стьюдента і призначали p 29. Пренатальна Т збільшувала експресію гена NFATc3 у 3,5 рази над контролем (р = 0,02, рис. 3). Вимірювання BNP та ANP, маркерів серцевої гіпертрофії, що виділяються у відповідь на перенапруження серцевої стінки, показали, що BNP збільшився у 8,2 рази у групі, яка отримувала пренатальну терапію, порівняно з контролем (р = 0,01, рис. 3), тоді як рівні ANP не відрізнялися між групами (зміна складання 1, 64: p = 0,28).
aMHC, домінуючий білок міофіламентних гризунів, який, як було показано, змінений на моделях серцевої гіпертрофії гризунів 30, 31, 32, був збільшений у 2-3 рази в групі, яка отримувала Т, що отримувала Т, порівняно з контролем (p = 0,046) (рис. 3)., На відміну від ßMHC, домінуючий білок міофіламенту у лівому шлуночку 33 дорослої людини не суттєво відрізнявся (зміна складок 2, 2: p = 0, 10) між двома групами.
Експресія стероїдних рецепторів
Хоча рецептори андрогену та естрогену експресувались у тканині овець лівого шлуночка, пренатальна терапія Т істотно не змінила експресію гена бета-альфа-рецептора андрогену або рецептора естрогену (зміна AR-фази 0,88 p = 0,40, зміна ER-бета-фали 2,2: 2: p = 0, 17, ER альфа кратна зміна 1, 5: p = 0, 64, рисунок 5).
Величина ефекту Коена виявила незначні відмінності між Т-обробленою та контрольною групами у експресії генів андрогенних та естрогенних рецепторів (AR = 0, 2, ER альфа 0, 26 та ER бета 0, 77) Скорочення: AR андрогенний рецептор, ER рецептор естрогену.
Повнорозмірне зображення
Результати гістології
У 5 з 8 жінок, які отримували пренатальний Т, спостерігався вогнищевий розлад міокарда в лівому шлуночку на фарбуванні H&E та Массона порівняно з контролем, який не мав ознак дезарктації міокарда (рис. 6а). Пренатальне лікування Т збільшило розмір кардіоміоцитів порівняно з контролем (оброблене Т 15,1 ± 0,4 мкм проти 13,6 ± 0,4 мкм, р = 0,02) (Рисунок 6b).
( A ) Репрезентативні гістологічні зрізи зрізів H&E з тканини лівого шлуночка у дворічних пренатальних овець, оброблених Т (А) та контролем (В). ( B ) Вплив пренатального лікування Т на середнє середнє значення кардіоміоцитів. * Позначає значення р 18, 22. Ці порушення молекулярної сигналізації можуть призвести до підвищеної сприйнятливості до пошкодження серця.
mTORC1 є одним із ключових регуляторів синтезу білка в кардіоміоцитах, і його активація призводить до гіпертрофії серця 41, 42. Він може активуватися факторами росту, включаючи інсулін, через його сигнальний шлях, а також Т 25, 43. Активація білка за рецептором інсуліну (PI3K/AKT/mTORC1) пов'язана з "фізіологічною гіпертрофією" в серці, але є також дані про "патологічну" гіпертрофію з хронічною активацією цього шляху 44, 45, 46, 47, 48, що призводить до порушення узгодженого росту тканин та ангіогенезу. Результати цього дослідження, які показують підвищену експресію mTORC1, PI3K та AKT, свідчать про те, що пренатальний надлишок Т може бути основою для активації серцевого сигнального шляху інсуліну, що призводить до активації mTORC1, що в кінцевому підсумку призводить до гіпертрофії серця. Підвищена експресія генів BNP та NFATc3, обох маркерів патологічної гіпертрофії, вказує на неадаптивну гіпертрофію.
Оскільки пренатальний надлишок Т призводить до материнської гіперінсулінемії 49 та постнатальної резистентності до інсуліну 18 у нащадків, ймовірно, що гіперінсулінемія матері також може бути головним гравцем у програмуванні пренатальної Т-індукованої серцевої гіпертрофії у нащадків. Наприклад, збільшення сигналізації PI3K/AKT/mTORC1 спостерігається у новонароджених із вродженою гіперінсулінемією 50, 51. Так само було показано, що гіперінсулінемія плода через ожиріння матері призводить до порушень серцевого програмування у нащадків із збільшенням маркерів гіпертрофії лівого шлуночка та збільшенням АКТ, а також mTOR 52 .
Хоча Т може призвести до гіпертрофії серця опосередковано за допомогою програмування гіперінсулінемії, не можна нехтувати можливістю прямого впливу андрогену на гіпертрофію серця. Ці тварини функціонально гіперандрогенні та мають підвищену експресію АР на рівні гіпоталамуса 53, гіпофіза (Кордозо та Падманабхан, неопубліковані) та яєчників 54. Кардіоміопатія спостерігається у новонароджених із вродженою гіперплазією надниркових залоз 55, стан, при якому плід піддається надмірному ендогенному андрогену. Рецептори андрогену та естрогену присутні в серцевій тканині як у цитозолі, так і в ядрі 19. Встановлено, що зв’язування статевих гормонів з їх рецепторами призводить до геномних та негеномних ефектів на серце, і одним із механізмів є активація шляху PI3K/AKT 19, що призводить до активації mTORC1 нижче, що призводить до посиленого синтезу білка і в кінцевому підсумку гіпертрофія серця 24. Хоча андрогенні рецептори експресуються в лівому шлуночку для полегшення прямих ефектів Т, відсутність змін експресії AR у жінок, які отримують пренатальний Т, свідчить про те, що будь-які прямі ефекти Т можуть опосередковуватися збільшенням ліганду (лікування Т), а не рецептором.
Встановлено, що Т збільшує поглинання глюкози кардіоміоцитами за рахунок збільшення транслокації GLUT4 56, і хоча в лівому шлуночку в базальних умовах не спостерігається збільшення експресії білка GLUT 4, збільшення експресії сигнальних білків інсуліну, включаючи IRS-1, PI3K та AKT, свідчить про збільшення лівого шлуночка метаболізм глюкози. Вільні жирні кислоти є основним паливом для виробництва енергії в серцевій тканині, але під час внутрішньоутробного життя та стресу серце повертається до глюкози як основного джерела палива 57. Підвищена експресія генів білків, що беруть участь у засвоєнні глюкози у пренатальних Т-жінок, може свідчити про адаптивну реакцію на підвищений метаболічний попит на серце, оскільки ми також спостерігаємо підвищену експресію BNP, маркера серцевого стресу. Збільшення експресії mTORC1 свідчить про те, що T може призвести до гіпертрофії серця через збільшення mTORC1, як уже пропонувалося 25 .
З погляду перекладу ці висновки можуть мати значення для потомства жінок із СПКЯ. Показано, що рівень андрогену та інсуліну підвищений у вагітних із СПКЯ 67, 68, і є дані, що іспанські когорти народжують дітей із зниженою вагою 69. Жіночі нащадки матерів СПКЯ мають ранні метаболічні розлади 70, подібні до тих, що спостерігаються у нашій пренатальній моделі Т18, що свідчить про те, що, подібно до пренатальної моделі Т-овець, наявність гіперандрогенії у жінок із СПКЯ може негативно програмувати кілька систем органів, включаючи серцево-судинну систему. у своїх нащадків.
Коротше кажучи, результати цього дослідження забезпечують докази серцевого перепрограмування на овечій моделі СПКЯ. Подальші дослідження, що з’ясовують функціональні наслідки таких змін, є життєво важливими і покращать наше розуміння впливу пренатального надлишку Т на здоров’я серця та допоможуть розробити нові стратегії лікування для запобігання сприйнятливості серця до пренатальних образів.
Матеріал і методи
Приблизно у віці 2 років, щоб уникнути впливу різних рівнів ендогенних стероїдів, всім тваринам проводили овариектомию та імплантували капсулу SILASTIC довжиною 1 см (внутрішній діаметр 3,35 мм та зовнішній діаметр 4,65 мм; Dow Corning Corp., Midland, MI ), завантажений 17β естрадіолом (естрадіол; Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США). Приблизно через місяць у кожну тварину підшкірно вводили два внутрішні імплантанти прогестеронового вивільнення (InterAG, Hamilton, Waikato, Нова Зеландія). Імплантати прогестерону видалили через 14 днів, і всі тварини отримали чотири додаткових імплантати естрадіолу довжиною 3 см для досягнення рівня стероїдів яєчників, виявлених під час пізньої фолікулярної фази. Тварин приносили в жертву
Через 20 годин після введення імплантатів естрадіолу під час передбачуваної пізньої фолікулярної фази циклу шляхом введення передозування барбітурату (Fatal Plus, Vortech Pharmaceuticals, Dearborn, MI). Серця збирали, а частини правого та лівого шлуночків заморожували швидко і зберігали при -80 ° C до обробки або стабілізації формаліну для гістологічної обробки. Інсулін у плазмі та глюкозу вимірювали до евтаназії після 48 годин голодування. Концентрації інсуліну визначали за допомогою радіоімунологічного аналізу (Insulin RIA Kit, MP Biomedicals). Чутливість інсулінового тесту становила 3,0 мкУ/л. Концентрації глюкози визначали методом глюкозооксидази (Pointe Scientific Inc.). CV між та під час тестування для тестів на інсулін та глюкозу були ефективними на 90%. Генспецифічні праймери були розроблені з використанням програмного забезпечення для вибору праймерів і докладно описані в додатковому матеріалі в Таблиці 1.
Аналіз ПЛР у реальному часі SYBR Green проводили з використанням сформованої кДНК. Для кожного зразка проводили негативний контроль зворотної транскриптази, щоб виключити забруднення виділеної РНК геномною ДНК. Кількісні реакції ПЛР в режимі реального часу проводили на приладі ПЛР у реальному часі Applied Biosystem 7200 та проводили у трьох примірниках. Результати випробувань визначали кількісно, використовуючи значення порогового циклу (КТ) кожного зразка. Значення КТ кожного гена, який нас цікавив, порівнювали зі значеннями побутового гена, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPDH). Тільки значення менше 35 вважалися позитивними. Результати кожного тесту перевірялися шляхом повторення результатів у другому тесті.
Вестерн-клякса
Гістопатологічний аналіз
Тканини лівого шлуночка фіксували у формальдегіді в PBS pH 7, 4. Потім тканину зневоднювали послідовними спиртами, очищали в ксилолах і вносили у парафін. Парафінові зрізи товщиною 5 мкм вирізали і фарбували гематоксиліном та еозином (H&E) для грубого аналізу зовнішнього вигляду. Контрастний фарбований гематоксилін (PAS-H) перйодат використовувався для полегшення кількісного визначення розміру кардіоміоцитів за допомогою нашої дослідницької лабораторії гістопатології в Університеті штату Мічиган Гістологічні зрізи досліджувались у довільному порядку двома незалежними ветеринарними патологоанатомами, які були засліплені для груп лікування.
гістоморфометрія
Згідно з раніше встановленими протоколами, 73, 74 середні діаметри кардіоміоцитів лівого шлуночка були визначені шляхом вимірювання короткої осі 100 кардіоміоцитів в ядерному перерізі з майже круглими капілярними профілями в 10 випадково вибраних мікроскопічних полях при збільшенні 400x. Вимірювання проводили за допомогою програмного забезпечення CellSens.
Статистичний аналіз
Детальніше
Як цитувати цю статтю: Vyas, AK і співавт. Пренатальне програмування: небажане серцеве програмування через надлишок гестаційного тестостерону. Наук. Респ. 6, 28335; doi: 10, 1038/srep28335 (2016).
Додаткова інформація
Документи Word
Додаткова інформація
Коментарі
Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов надання послуг та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте щось образливим або не відповідаєте нашим умовам чи інструкціям, позначте це як невідповідне.