- Предмети
- Резюме
- Вступ
- Предмети та методи
- Відбір зразків
- Підготовка та групування ДНК
- Секвенування екзома
- Прочитайте послідовність відображення, виклик варіантів та функціональну анотацію
- Варіантна фільтрація та збагачення при ожирінні.
- Перевірка варіантів методом генотипування
- Статистичний аналіз асоціації.
- Результати
- Відкриття рідкісних варіантів шляхом секвенування екзоми
- SNV перевірка та аналіз асоціації
- Обговорення
- Додаткова інформація
- Документи Word
- Додаткова інформація
Предмети
Резюме
Вступ
Нещодавно розроблена високопродуктивна технологія секвенування доповнює масиви SNP і демонструє можливість виявлення варіантів, що викликають рідкісні захворювання, шляхом глибокого секвенування всіх відомих екзонів. 7, 8, 9 Ця технологічна революція обіцяє з’ясувати складні захворювання, дозволивши низькочастотний пошук цілого геному та рідкісні та нібито функціональні варіанти. Секвенування екзоме може бути більш ефективним, якщо застосовувати його до пацієнтів з більш екстремальними формами загальних захворювань, таких як патологічне ожиріння; по-перше, це збільшує шанси отримати значну асоціацію для рідкісних варіантів з високим проникненням; по-друге, генетичні варіанти в послідовності, що кодує білок, можуть з більшою ймовірністю мати сильний вплив на фенотип, ніж варіанти в міжгенних регіонах.
У цьому дослідженні ми використовували секвенування екзоми, щоб виявити збагачені низькочастотні та рідкісні варіанти генів у хворих із ожирінням дорослих суб'єктів та перевірили їх проти людей, що не страждають ожирінням, у літніх людей. Ми розсудили, що таким чином ми збагатимо гени ожиріння серед випадків і відфільтруємо ці гени в контролі. Тут ми повідомляємо про асоційований з ожирінням варіант у кодуючій області гена синаптофізину типу 2 (SYPL2).
Предмети та методи
Відбір зразків
Повний розмір таблиці
Контроль, що не страждає ожирінням, для секвенування екзоми мав сколіоз. В іншому випадку всі інші суб’єкти контролю були здоровими згідно з самозвітом. У досліджуваних когортах спостерігалося надмірне представництво жінок. Повні жінки частіше звертаються за медичною допомогою щодо ожиріння. Сколіоз частіше зустрічається серед жінок. Піддослідні були європейського походження і жили в Швеції. Дослідження було схвалено місцевими комітетами з етики, і всі суб’єкти дали свою поінформовану згоду на участь.
Підготовка та групування ДНК
Геномну ДНК готували з PBMC, використовуючи набір QiAmp DNA Blood Maxi Kit (Cat. No. 51194, Qiagen, Hilden, Germany). Чистота та якість ДНК була підтверджена співвідношенням A260/280> 1,8 у Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) та електрофорезі в агарозному гелі. Концентрацію ДНК вимірювали за допомогою Qubit (Life Technologies, Стокгольм, Швеція). Згодом ми взяли 0,8 мкг з кожної проби ДНК і випадковим чином розділили їх на 10 груп, кожна з 10 зразками з випадків ожиріння або контролів. Об'єднані концентрації зразків ДНК вимірювали за допомогою Qubit, і проби проводили на агарозному гелі.
Секвенування екзома
Секвенування екзомів проводили в лабораторії Science for Life (SciLifeLab), Стокгольм, Швеція. Кожну бібліотеку ДНК готували з 3 мкг об'єднаної геномної ДНК. ДНК розрізали зі швидкістю 300 п.н. за допомогою інструменту Covaris S2 та збагатили набором SureSelectXT Human All Exon 50 Мб та робочою станцією Agilent NGS згідно з інструкціями виробника (SureSelectXT Автоматизоване збагачення цілей для парного мультиплексного секвенування Illumina, версія A, Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США).
Об’єднання було здійснено в системі побудови кластера cBot за допомогою парного набору збірних кластерів HiSeq у відповідності до інструкцій виробника (Illumina, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Зразки секвенували на Illumina HiSeq 2000 у режимі парного зчитування при 100 bp/read (Illumina). Усі смуги були збагачені 1% контрольною бібліотекою phiX, за винятком смуги 8, яка становила 2% phiX. Послідовність послідовностей проводили відповідно до інструкцій виробника. Базове перетворення було виконано за допомогою Illumina OLB v1.9 (Illumina).
Прочитайте послідовність відображення, виклик варіантів та функціональну анотацію
Зчитування послідовності було вирівняно до поточної еталонної послідовності людини (збірка hg19, збірка NCBI 37) (//hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/) за допомогою вирівнювача Burrows-Wheeler (версія BWA 0.6.1,//bio-bwa.sourceforge.net/, Li та Durbin 12) з параметром відсікання зчитування - q 20. Варіанти послідовностей викликалися функцією багаторазового накопичення samtools-0.1.18 (//samtools.sourceforge. net /), з мінімальною якістю відображення 20 і мінімальною глибиною зчитування 5 × для фільтрації. Дублікати ПЛР видаляли за допомогою самтулів до так званого варіанту. Для функціональної анотації варіантів послідовностей ми використовували ановар (//www.openbioinformatics.org/annovar/, Wang et al. 13) для інтеграції інформації з різних баз даних у відкриті домени, наприклад, посилання на ген (/ /hgdownload.soe . ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/refGene.txt, 2013), dbSNP (SNP135, //hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp137.txt.gz) та проект 1000 Genome (//www.1000genomes.org/).
Варіантна фільтрація та збагачення при ожирінні.
Ми використовуємо наступні критерії скринінгу для вибору низькочастотних та рідкісних однонуклеотидних варіантів (SNV) з даних секвенування екзоми. Збагачені SNV у хворих на ожиріння пацієнтів проводили для перевірки (рис. 1). Спочатку ми фільтруємо варіанти з глибиною 5 × та якістю відображення (MQ) ≥20. Потім ми шукаємо передбачувано функціональні варіанти, тобто варіанти екзонових областей, сайтів сплайсингу або 5-дюймових областей вище за течією. На наступному кроці ми порівнюємо випадки варіанта між ожирінням та контрольними групами. На додатковому етапі фільтрації використовувались лише варіанти, викликані в ≥2 ожиріних групах, але жоден виклик або один раз не викликався в контрольних групах; Цей крок було застосовано, щоб уникнути можливих хибнопозитивних варіантів. Остання фільтрація базувалася на частоті алелів. Ми шукали низькочастотні та рідкісні SNV, тобто варіанти, які не були знайдені в загальнодоступних базах даних або відомі SNP з MAF≤5% у загальних популяціях (проект 1000 Genomes 2011, травнева версія).
Короткий зміст робочих процесів. Неопубліковані SNV: варіанти, які не включені до SNP135.
Повнорозмірне зображення
Перевірка варіантів методом генотипування
Статистичний аналіз асоціації.
Суб'єкти характеризувались ІМТ, і значення повідомлялись як середнє значення ± SD для ожиріння та контрольних груп окремо. Аналіз генетичної асоціації та розрахунок коефіцієнта шансів проводили за допомогою PLINK (//pngu.mgh.harvard.edu/
purcell/plink /, Purcell et al 16). Рівновага частоти генотипу між випадками та контролями Харді-Вайнберга (HWE) перевірялася окремо для кожного циклу валідації перед аналізом асоціації. Номінальне значення HWE P 0,01 у контролях було використано як граничну точку для виключення варіантів з подальшого аналізу. ІМТ аналізували за допомогою стандартної лінійної регресії, реалізованої в PLINK. Стать і вік використовувались як коваріати для оцінки їх впливу на зв'язок варіанту з ІМТ.
Результати
Відкриття рідкісних варіантів шляхом секвенування екзоми
Повний розмір таблиці
SNV перевірка та аналіз асоціації
З SNV 1032 ми виключили варіанти вставки або видалення, щоб уникнути можливих технічних труднощів при генотипуванні. Потім ми фільтруємо SNV, що використовуються принаймні двома групами ожиріння з найвищою ефективністю. Після ручної перевірки вирівнювання зчитувань, що містять варіанти, за допомогою програмного забезпечення IGV (//www.broadinstitute.org/igv/) для виключення можливих артефактів, ми вибрали 144 SNV для генотипу (142 dbSNP і 2 невідомих SNV). Глибина послідовності та кількість спільних груп ожиріння 144 SNV показані в Додатковій таблиці S3. Більшість SNV були виявлені у двох (83) або трьох (31) групах. Десять SNV мали труднощі в конструкції грунтовки для генотипування і були замінені SNV singleton.
Повний розмір таблиці
Важливість асоціації 5 СНВ із ожирінням або ІМТ у першому та заключному аналізах не зазнала впливу, коли для аналізів ми виключили 100 суб’єктів, які використовувались в послідовності екзоми (Додаткові таблиці S6 та S7).
Для подальшої оцінки будь-яких незрозумілих наслідків віку чи статі ми додали ці змінні як коваріати в регресійних моделях та протестували їхні окремі ефекти окремо. rs62623713 зберігав сильну асоціацію з ІМТ після корекції віку чи статі (Додаткова таблиця S8). Зв'язок між rs35923425 та ІМТ зник після поправки на вік. Крім того, ми також проводимо різноманітні тести, щоб скоригувати аналіз для кількох генетичних варіантів. Асоціація rs62623713 з ІМТ все ще була значущою з відрегульованим Бонферроні значенням Р 3,0 × 10 -4 та значенням P, скоригованим геномним контролем, 0,05. Асоціація rs35923425 стала несуттєвою з геномними контролями, тоді як значення P, виправлене Бонферроні, становило 0,029 (Додаткова таблиця S9).
Обговорення
Використовуючи секвенування екзомів з подальшим широкомасштабним генотипуванням, ми виявили низькочастотний варіант кодування rs62623713 (E99G) в екзоні 4 гена SYPL2, який демонструє стійку асоціацію із захворюваним ожирінням. rs62623713 має MAF 2,9% для алелю G у загальних популяціях згідно з 1000 геномами. Варіант надмірно представлений серед наших пацієнтів із ожирінням (MAF 8%). rs62623713 не охоплювався матрицями генотипування Illumina або Affymetrix, що використовувались у попередніх дослідженнях GWA, і жоден інший варіант у цих матрицях не мав різкої рівноваги міцного зв'язку з rs62623713.
Наскільки нам відомо, є лише три повідомлення про варіанти, пов’язані з ожирінням, виявлені шляхом секвенування екзоми. 9, 17, 18 Альбрехтсен та ін. 17 проаналізували когорту з метаболічним синдромом та дослідили множинні метаболічні фенотипи. У дослідженні Huang та співавт. 18 в основному аналізували діабет типу 2. Гілл та ін. 9 ідентифікували нові варіанти LEPR при важкому ожирінні в дитинстві через секвенування екзоми.
Гіпотеза, яка лежить в основі нашого дослідження, полягає в тому, що найважчі форми загального ожиріння можуть бути зумовлені низькочастотними або рідкісними варіантами, що мають більший вплив на фенотип. Показано, що невелика частина захворюваності на ожиріння зумовлена генетичними варіантами високої пенетрантності. Варіанти гена рецептора меланокортину 4 (MC4R) пояснюють невеликий відсоток дитячого ожиріння19, а повторення числа копій у хромосомі 16-20 має високу пенетрантність у деяких відсотках хворих із ожирінням осіб із когнітивними дефектами. Ми не виявили жодного варіанту в екзонічних або поблизу вищих областях MC4R в наших даних секвенування екзоми, що може бути пов'язано з низькою кількістю досліджуваних. Наші результати, тобто виявлення SNP у SYPL2, який залишається суттєво пов’язаним із ожирінням після коригування багаторазових тестів, підтверджують думку, що рідкісні та низькочастотні варіанти сприяють захворюванню на ожиріння. Однак у цьому дослідженні бракує сили оцінити, наскільки рідкісні генетичні варіанти спричиняють патологічне ожиріння серед популяції.
SYPL2 (також званий MG29) експресується в жировій тканині, мозку, нирках, серці та мозочку. Функціонально було запропоновано, що білок SYPL2 бере участь у клітинному гомеостазі іонів кальцію. 21 Білок, як очікується, братиме участь у активності транспортера та локалізуватиметься в декількох відділеннях, таких як синаптична везикула. 22 Цікаво, що миші, у яких відсутній Sypl2/Mg29, демонструють знижену масу тіла, ненормальні оболонки скелетних м’язів та нерегулярну скоротливу здатність скелетних м’язів. 23 Як ген може впливати на формування жирової тканини та його потенційну роль у розвитку ожиріння, незрозуміло і потребує додаткових досліджень, що виходить за рамки цього дослідження.
У попередніх звітах SYPL2 асоціювався з великим депресивним розладом серед європейського населення. 24 Неодноразово встановлювали зв'язок між ожирінням та депресією. В ході мета-аналізу виявлено, що ожиріння збільшує ризик депресії. Крім того, виявилось, що депресія передбачає ожиріння. Інше дослідження показало, що асоціація ожиріння з депресією в основному обмежена людьми із сильним ожирінням. 26
SYPL2 належить до сімейства синаптофізинів. Синаптофізин регулює формування активного синапсу в культивованих нейронах гіпокампа, 27 і необхідний для кінетично ефективного ендоцитозу синаптичних пухирців у культивованих нейронах гіпокампа. 28 Вживання їжі підлягає комплексному регулюванню гіпоталамусом та іншими мозковими центрами, включаючи стовбур мозку та гіпокамп. Отже, можна припустити, що SYPL2 бере участь у центральному регулюванні споживання їжі, можливо впливаючи на центральні системи винагороди та гедонічні ефекти їжі.
На закінчення ми виявили низькочастотний варіант кодування, пов'язаний із ожирінням, у гені SYPL2, використовуючи об'єднане секвенування екзоми ДНК 100 пацієнтів із ожирінням та 100 осіб, що не страждають ожирінням, з подальшим підтвердженням генотипу у 3197 пацієнтів. Наші результати дають докази існування варіанту кодування, пов’язаного з ожирінням, хоча подальші функціональні дослідження цього генетичного варіанту ще не проводились.