- предметів
- реферат
- Головний
- результат
- Розробка та виготовлення злитих білків TRAIL
- Цільове антиген-специфічне зв’язування scFv-scTRAIL
- Цільова індукція антиген-обмеженої загибелі клітин scFv - scTRAIL
- Індукція апоптозу scFv-scTRAIL, опосередкована TRAIL-R2
- Період напіввиведення з сироватки scFv - scTRAIL
- Вплив пухлини на карциноми товстої кишки у оголених мишей
- обговорення
- глосарій
предметів
- рак
- фармакодинаміка
- фармакокінетика
- Рекомбінантна білкова терапія
реферат
Головний
Нещодавно була описана одноланцюгова молекула TNF, що складається з трьох мономерів TNF, злитих короткими пептидними лінкерами, яка виявляє підвищену стабільність та протипухлинну активність. Ми запропонували аналогічний варіант єдиного поліпептидного ланцюга TRAIL (scTRAIL), який був використаний для побудови злитого білка scFv-scTRAIL для націлювання на пухлину. Ми порівняли біологічну активність цього злитого білка з нецільовим scTRAIL на моделях пухлин in vitro та in vivo. Тут ми покажемо, що злитий білок scTRAIL пухлинного антигену демонстрував вищу апоптотичну активність щодо scTRAIL in vitro, з переважним ефектом сигналізації TRAIL-R2 на клітини карциноми товстої кишки Colo205. Дослідження in vivo на моделі ксенотрансплантата пухлини миші підтвердили значно вищу відповідь на злитий білок scTRAIL, орієнтований на ErbB2.
результат
Розробка та виготовлення злитих білків TRAIL
Щоб створити одноланцюгову молекулу TRAIL, ми дотримувались принципу проектування, описаного для scTNF 20, і ковалентно зливали три мономери TRAIL, кожен з яких складається з позаклітинного домену TRAIL (aa 95-281) через два пептидні лінкери, що містять чотири повтори послідовності GGGS. (Малюнок 1а). Для полегшення очищення та аналізу було додано N-кінцеву мітку FLAG. Потім, шляхом подальшого злиття N-кінця одноцепочечного фрагмента антитіла (scFv), що розпізнає епітоп FRP5 у позаклітинному домені ErbB2, 21, ми створили ErTB2-специфічний злитий білок scTRAIL (рис. 1а).
Біохімічний аналіз scTRAIL та scFv - scTRAIL. a ) Схема злитих білків scTRAIL, використаних у цьому дослідженні. L, лідерний пептид; scFv, людський ErbB2-специфічний одноланцюговий фрагмент антитіла; F, позначка FLAG; СЛІД, СЛІД людини (aa 95–281). ( b ) Очищений scTRAIL (доріжка 1) та scFv-scTRAIL (доріжка 2) аналізували за допомогою SDS-PAGE (10%, умови відновлення), після чого проводили імуноблот-аналіз (ліворуч, 250 нг білок/смуга) або фарбування сріблом (праворуч, 1 мкг білка)./бар). Для імуноблотингу використовували моноклональне антитіло Anti-FLAG M2 та кон'юговане з лужною фосфатазою вторинне антитіло. ( c ) Варіанти TRAIL розділяли гель-фільтрацією на колонці BioSuite250. Пунктирними лініями вказано час утримання стандартів молекулярної маси апоферритину (443 кДа), β-амілази (200 кДа), бичачого сироваткового альбуміну (66 кДа) та вуглекислої ангідрази (29 кДа). Зібрані фракції аналізували за допомогою імуноблотингу, як в b . Для фракцій scTRAIL 1-9 (кожна друга фракція; перша частина), фракції 11-16 (друга частина) та фракції 19-26 (кожна друга фракція; третя частина) були імуноблотовані. Для scFv-scTRAIL фракції 8-24 були імуноблотовані
Повнорозмірне зображення
І scTRAIL, і scFv-scTRAIL очищали афінною хроматографією на моноклональній агарозі M2 anti-FLAG від супернатанту стабільно трансфікованих клітин HEK293 з виходом близько 1 мг білка на літр супернатанту клітинної культури. Імуноблот-аналіз та SDS-PAGE (рис. 1b) очищеного білка показали окремі білкові смуги з молекулярною масою -70 кДа для scTRAIL та
100 кДа для scFv-scTRAIL, що відповідає очікуваним розрахунковим молекулярним вагам 71 та 98 кДа, відповідно. Аналіз гель-фільтрації показав мономерну організацію обох варіантів scTRAIL, що відповідає по відношенню до фрагменту TRAIL нековалентно зібраному тримеру звичайної рекомбінантної молекули TRAIL (рис. 1в). Молекулярні ваги, отримані з SEC, були трохи нижчими порівняно з вагою, отриманою з SDS-PAGE (рис. 1b), яка не була результатом деградації, як підтверджено імуноблот-аналізом об'єднаних фракцій (рис. 1c). У препараті scTRAIL незначна фракція, елюйована в SEC із, мабуть, більшою молекулярною масою, тобто потенційно містить агреговані комплекси, не виявляла непропорційно високої біологічної активності, як це було виявлено при порівнянні цитотоксичної активності фракцій 2 і 15, беручи до уваги відносний білок суми (дані не відображаються).
Цільове антиген-специфічне зв’язування scFv-scTRAIL
Для аналізу специфічного зв'язування scFv-scTRAIL з ErbB2-позитивними клітинами був проведений аналіз проточної цитометрії. Аналіз експресії ErbB2 підтвердив помірний та низький рівень експресії для клітин карциноми товстої кишки Colo205 та клітин фібросаркоми HT1080 (рис. 2а) порівняно з клітинами SKBR3, які, як відомо, високо експресують білок ErbB2 (дані не наведені). Інкубація клітин Colo205 та HT1080 із злитим білком виявила специфічне зв’язування з ErbB2-позитивними клітинами (рис. 2а та b) порівняно з інкубацією з нецільовим scTRAIL, що призводило до слабкого флуоресцентного сигналу, або шляхом виявлення анти-TRAIL (рис. ) або з антитілами проти FLAG (дані не наведені). Оскільки зв'язування гомотримерного FLAG-міченого TRAIL демонструвало подібні слабкі сигнали (дані не наведені), це може відображати низький рівень експресії рецептора TRAIL (TRAILR) на досліджених клітинах-мішенях та/або недостатню чутливість аналізів FACS. ЕрбВ2-специфічне зв’язування було підтверджене за допомогою злитих білків TRAILR1 та R2-Fc для виявлення зв’язування scFv-scTRAIL з клітинами-мішенями (рис. 2b) та конкуренції з анти-ErbB2 антитілами (FRP5). Це призвело до майже повного пригнічення зв’язування scFv-scTRAIL з ErbB2-позитивною клітинною лінією (рис. 2b).
Повнорозмірне зображення
Період напіввиведення з сироватки scFv - scTRAIL
Для оцінки фармакокінетичних властивостей scFv-scTRAIL порівняно з scTRAIL, зразки сироватки відбирали після внутрішньовенного (iv) введення 400 пмоль окремим мишам Balb/c. В обох випадках відносні концентрації в сироватці крові, побудовані за часом, були добре адаптовані до двофазної кривої експоненціальної регресії спаду. Протягом 20 хвилин після ін’єкції обидва варіанти TRAIL продемонстрували подібну кінетику із періодом напіввиведення в сироватці ∼ 35 хвилин (t 1/2 α). Пізніше було виявлено незначну, але значну різницю в біодоступності з періодами напіввиведення (t ½ β) 160 та 124 хв та AUC 11 191 та 8125 для scFv-scTRAIL та scTRAIL (Малюнок 5а). Таким чином, специфічний для ErbB2 злитий білок ефективніше утримувався в крові, що могло позитивно впливати на терапевтичну активність.
Повнорозмірне зображення
Вплив пухлини на карциноми товстої кишки у оголених мишей
На закінчення, наші дані забезпечують докази того, що біоактивні одноланцюгові злиті білки TRAIL можуть генеруватися. Крім того, злиття з цільовим специфічним антитілом scFv призводить до цілезалежного збільшення опосередкованої TRAIL цитотоксичності in vitro, ймовірно, завдяки ефективній активації TRAIL-R2, та покращує протипухлинну активність in vivo. Відповідно, ця концепція дизайну представляє перспективну стратегію для посилення протипухлинної дії TRAIL та мінімізації потенційних небажаних нецільових дій на нормальні тканини.