• реферат
  • вступ
  • результат
  • Соєвий пептид пригнічував індукований DMBA туморогенез молочних залоз
  • Соєвий пептид пригнічував експресію білків HSP90 та NF-κB у природніх умовах
  • Індукований пептидом сої апоптоз у клітинах раку молочної залози людини
  • обговорення
  • методи
  • звір
  • Приготування дієти та приготування пептиду сої
  • Модель пухлини молочної залози
  • Аналіз мікрочіпів
  • Імуноблот-аналіз та колориметричний аналіз активності каспази-3
  • імуногістохімія
  • Культура клітин та аналіз МТТ
  • Тести на апоптоз
  • Статистичний аналіз
  • глосарій

реферат

Під час канцерогенезу NF-κB опосередковує процеси, пов'язані з дерегуляцією нормального контролю проліферації, ангіогенезу та метастазування. Таким чином, придушення NF-κB пов'язане з хіміопрофілактикою раку. Колективні результати показують, що білок теплового шоку 90 (HSP90) є молекулярним шапероном і є частиною комплексу IκB-кінази (IKK), який відіграє центральну роль в активації NF-κB. HSP90 також стабілізує ключові білки, що беруть участь у контролі клітинного циклу та передачі сигналів апоптозу. Ми досліджували, чи екзогенне введення ізофлавонового збідненого соєвого пептиду запобігало 7,12-диметилбенз [а] антрацену (DMBA), індукований пухлиною щурів у щурів, та досліджували механізм дії. Дієтичне введення соєвого пептиду (3,3 г/щур/добу) суттєво зменшило частоту розвитку протокових карцином (50%), кількість пухлин на кількох щурах, що несуть пухлину (49%; Р

пептид

Експериментальна конструкція індукованого DMBA туморогенезу молочної залози щурів. Три групи 4-тижневих самок щурів Sprague Dawley годували контрольною дієтою або соєвим пептидним раціоном протягом 4 тижнів перед введенням DMBA. Кожна дієта тривала з 9 тижня до кінця експерименту. Кожна група складалася з 12 щурів. Контрольна дієта + введення кунжутного масла; Контрольна дієта + введення DMBA; Соєва пептидна дієта + введення DMBA.

Повнорозмірне зображення

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

Соєвий пептид пригнічує експресію білків NF-κB та HSP90 in vivo. (А) Репрезентативне імуногістохімічне фарбування тканини пухлини молочної залози з контрольної дієти + DMBA та соєвого пептиду + ​​DMBA. Імуногістохімічне фарбування білків HSP90 та NF-kB (p65) показало сильне позитивне фарбування при протоковій карциномі з контрольної дієти + група DMBA (ліва панель), при дуже слабкому фарбуванні кожного білка в пептиді сої + група DMBA (права панель), 400 ×. (В) Вплив пептиду сої на експресію білка, пов’язаного з апоптозом. Екстракт цільної тканини, приготовлений із тканини молочної залози, отриманої від тварин з кожної групи, аналізували за допомогою Вестерн-блот-аналізу із зазначеним антитілом, як описано в процедурах. Control-актин використовували як контроль навантаження. (C) Соєвий пептид + група DMBA підвищує активність каспази-3. Активність каспази-3 оцінювали за допомогою субстрату DEVD з цілими лізатами тканин, приготованими з контрольної дієти + пухлини DMBA або пептид сої + DMBA.

Повнорозмірне зображення

Індукований пептидом сої апоптоз у клітинах раку молочної залози людини

Щоб дослідити, чи пригнічував соєвий пептид ріст клітин раку молочної залози людини, клітини MCF-7 інкубували протягом 72 годин у присутності різних концентрацій соєвого пептиду, і ріст клітин оцінювали за допомогою аналізу МТТ. Соєвий пептид пригнічував ріст клітин MCF-7 залежно від дози, майже на 50% пригнічуючи життєздатність клітин при концентрації 500 мкМ (рис. 4А). Обробка соєвого пептиду при 1 мМ протягом 24 годин викликала значну фрагментацію ядер, про що свідчить ядерне фарбування DAPI, а також клітинні морфологічні зміни (рис. 4B). Індукція апоптозу була додатково підтверджена подвійним фарбуванням анексину V-PI (Фігура 4С). Ми спостерігали збільшення в 7 разів апоптозу в клітинах, оброблених пептидом сої.

Придушення NF-κB та HSP90 соєвим пептидом індукує апоптоз клітин MCF-7 молочної залози людини. (A) Клітини MCF-7 висівали в 96-лункову платівку при 5 х 10 3 клітинах та інкубували при 37 ° C. Після інкубації протягом ночі клітини вирощували у свіжому контрольному середовищі або у свіжому середовищі, що містить зазначену концентрацію сої пептиду протягом 72 годин. Ріст клітин визначали за середньою абсорбцією. Кожен експеримент проводився у трьох примірниках. (B) Соєвий пептид викликає фрагментацію ядер. Клітини MCF-7, висаджені на 4-камерному предметному склі, обробляли 1 мМ соєвим пептидом протягом 24 годин і потім фіксували в етанолі з подальшим фарбуванням DAPI. Морфологію клітин спостерігали за допомогою світлової мікроскопії, а ядра досліджували за допомогою флуоресцентної мікроскопії. (C) Індукція апоптотичної загибелі клітин пептидом сої. Клітини MCF-7, оброблені середнім або 1 мМ соєвим пептидом протягом 24 годин, інкубували з міченим FITC анексином V та PI, а потім аналізували FACS. (D) Короткий зміст для придушення пухлинної пухлини молочної залози безізофлавоновим пептидом сої.

Повнорозмірне зображення

обговорення

Для подальшого вивчення механізму хіміопрофілактичного та супресивного до пухлини ефекту соєвого пептиду ми шукали молекули-мішені та виявили HSP90 як один із регульованих генів. Крім того, наш мікрочип кДНК виявив різке пригнічення циклінозалежної кінази 4 (cdk4) та мРНК VEGF у тканинах щурів, які отримували соєвий пептидний раціон (табл. 3). В цілому, соєвий пептид може чинити хіміопрофілактичний та супресивний до пухлини ефект, пригнічуючи опосередковану NF-κB передачу сигналів.

HSP90 - це молекулярний шаперон, необхідний для стабільності та функціонування багатьох сигнальних білків, що беруть участь у сприянні росту чи виживанню ракових клітин, або обох. Важливі білки, такі як Akt, Raf, Cdk4, Her2 та HIF-1α, були визначені клієнтами HSP, які часто беруть участь у перекритті шляхів виживання ракових клітин (Maloney and Workman, 2002; Neckers and Ivy 2003; Takayama et al., Та ін.)., 2003). Члени HSP90 також необхідні для індуцибельної та конститутивної активності комплексу IKK та NF-κB (Broemer et al., 2004). Наш аналіз мікрочипів кДНК також передбачає потенційну участь соєвого пептиду в інших важливих процесах, таких як інвазія пухлини та ангіогенез, контроль експресії ключових генів та активності. Разом соєвий пептид може інгібувати безліч важливих біологічних процесів, пов’язаних з апоптозом, прогресуванням клітинного циклу, ангіогенезом та інвазією пухлини, що призводить до його хіміопрофілактичного та супресивного ефекту на пухлину молочної залози in vivo. .

Коротко, одним з основних висновків цього дослідження було те, що вільний від ізофлавону соєвий пептид може чинити свій хіміопрофілактичний та супресивний вплив на пухлину шляхом інгібування сигнального шляху NF-κB, що бере участь у багатьох аспектах пухлини. Пригнічення основного ангіогенного фактора VEGF соєвим пептидом також свідчить про його потенційний антиангіогенний ефект, опосередкований супресією NF-κB при пухлинах молочної залози. Дослідження, що вивчають вплив соєвого пептиду на інші процеси, пов’язані з ангіогенезом та метастазуванням, а також стійкість до лікарських засобів, дадуть подальше розуміння механізму виснаженого ізофлавоном пептиду сої у профілактиці та/або придушенні раку молочної залози разом з мінімальними побічними ефектами .

методи

Самки щурів Sprague-Dawley були придбані у Daehan Biolink Co., LTD (Чунбук, Корея). У віці 3 тижнів щурів годували дієтою росту AIN-76 (Американський інститут харчування 76) протягом 1 тижня. Тварин розміщували в приміщенні, де підтримували постійну температуру (22 ± 2 ° C) та вологість (55 ± 5%) при 12 годин світла та 12 годин темряви на день. У віці 4 тижнів щурів розподілили до однієї з трьох груп: 1) контрольна дієта + група кунжутного масла (n = 12) отримувала контрольну дієту і служила негативним контролем; 2) контрольна дієта + група DMBA (n = 12) була визначена позитивним контролем і отримала контрольну дієту; 3) група соєвого пептиду + ​​DMBA (n = 12) отримувала експериментальну дієту, що містить соєвий пептид (див. інфра). Дієти забезпечувались у вигляді порошку, а вода з-під крана забезпечувалась за потребою для всіх трьох груп.

Приготування дієти та приготування пептиду сої

Дієта AIN-76 була модифікованою дієтою Американського інституту харчування 76, що складається з 18% білка, 10% жиру, 15% кукурудзяного крохмалю, 5% целюлози, 3,5% мінеральної суміші AIN-76, 1% вітамінної АІН, 0,2, 2% білін бітратрату холіну і 47,3% сахарози. Контрольна дієта забезпечувала білок казеїном і була ізокалорійною та ізопротеїновою. Соєва пептидна дієта також передбачала

Модель пухлини молочної залози

Аналіз мікрочіпів

Загальну РНК із вирізаних пухлин молочної залози виділяли за допомогою екстрагенту TRIzol (Gibco BRL, Rockville, MD) відповідно до рекомендацій виробника. Цілісність MRNA підтверджена денатурацією 1% електрофорезу в агарозному гелі. Мікрочип кДНК щурів містив 5K клони кДНК, вибрані з індексу генів щурів GenomicTree Inc. (Теджун, Корея).

Імуноблот-аналіз та колориметричний аналіз активності каспази-3

Нормальні молочні залози щурів та пухлини молочної залози (по 100 мг) гомогенізували в 800 мкл крижаного буфера гомогенізації (20 мМ HEPES [рН 7,4), 75 мМ NaCl, 2,5 мМ MgCl 2, 0,2 мМ ЕДТА, 0,2 05% Тритону X -100, 20 мМ β-гліцерофосфату, 1 мМ Na 3 VO 4, 0,5 мМ DTT, 10 мМ NaF та коктейль-інгібітор протеази (Рош, Мангейм, Німеччина), як описано раніше (Lee et al., 2002) Лізати тканин (50 мкг ) розділяли SDS-PAGE та імуноблотували зазначеними первинними антитілами проти NF-κB (р65, 1: 500), HSP90 (1: 1000), р53 (1: 1000), р21. (1: 500) та каспазу- 3 (1: 1000) з наступною інкубацією з відповідними кон'югованими HRP вторинними антитілами протягом 1 години, а потім виявляють за допомогою реагенту ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL), як описано раніше (Park et al., 2005). така ж кількість білків була підтверджена інкубацією з анти-β-актиновим антитілом.Для визначення активності каспази-3 40 мкг кожного тканинного лізату інкубували з колориметром i c субстрат DEVD (Calbiochem) при 30 ° C протягом 3 годин, а потім поглинання при 405 нм (OD 405) вимірювали за допомогою зчитувача спектрометрії Xfluor 4 (TECAN, Австрія).

імуногістохімія

Фарбування імунопероксидазою проводили згідно з протоколами, наданими виробником (набір Dako LSAB; Dako, Carpinteria, CA), як описано раніше (Nam et al., 2001). Коротко, ділянки товщиною 5 мкм, встановлені на предметних стеклах, обробляли зазначеними первинними антитілами (анти-NF-κB [p65], 1: 500; Santa Cruz Biotechnology Inc., Санта-Крус, Каліфорнія) або анти-HSP90 антитілом (1).: 1000; Stressgen Biotechnologies, Вікторія, Канада), а потім інкубація з біотинільованими вторинними антитілами. Зв’язану пероксидазу візуалізували додаванням розчину субстрату-DAB, а предметні стекла фарбували гематоксиліном Майєра (DAKO) для фарбування ядер. Позитивно забарвлені клітини виглядали коричневими, тоді як негативні - синім.

Культура клітин та аналіз МТТ

Клітини MCF-7, отримані з аденокарциноми молочної залози людини, були отримані з Американської колекції типових культур (ATCC, Rockville, MD). Клітини вирощували в RPMI 1640 з добавкою 10% FBS та 1% пеніциліну та стрептоміцину в атмосфері 5% CO 2 при 37 ° C. Колориметричний аналіз МТТ проводили, як описано вище (Park et al., 2001). Інгібування росту вимірювали за середньою абсорбцією за допомогою планшетного зчитувача (Termomax, Molecular Device) при 540 нм. Кожен експеримент проводився у трьох примірниках.

Тести на апоптоз

Апоптоз-опосередкована загибель клітин досліджували, як описано (Lee et al., 2008), з незначними змінами. Коротко кажучи, клітини MCF-7 висівали на предметні предметні стекла щільністю 5 х 104 клітини на лунку, а потім обробляли 1 мМ соєвим пептидом, розчиненим у середовищі RPMI 1640 протягом 24 годин. Клітини інкубували з міченим анексином V та флуоресцеїн ізотіоціанатом (FITC) йодованим пропідієм йодидом (PI) протягом 15 хвилин, а потім аналізували на FACS Vantage (Becton Dickinson, San Jose, CA). Для оцінки морфології ядер клітини поміщали на предметне скло, фіксували в метанолі і фарбували DAPI (1 мкг/мл у метанолі) протягом 15 хвилин, тричі промивали 1 x PBS, а потім обробляли VectaShield (Vector Laboratories) ( Берлінгейм, США), Каліфорнія) і досліджували під флуоресцентним мікроскопом.

Статистичний аналіз

Визначали масу тіла та споживання їжі, а статистичну значущість відмінностей у даних оцінювали за допомогою одностороннього дослідження ANOVA. Вага пухлини, затримка, об’єм пухлини та множинність пухлини розраховувались за допомогою незалежного t-тесту в кожен момент часу. Значення ймовірності COX-2 вважали статистично значущим