стимульована

  • Резюме
  • Довіритель
  • МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
  • Процедури з тваринами.
  • Кількісне визначення рівнів експресії мРНК.
  • Статистика.
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • ОБГОВОРЕННЯ
  • Глосарій

Резюме

У дитинстві основні умови перетравлення харчового жиру відрізняються від умов дорослого життя. Стимульована жовчною сіллю ліпаза (BSSL) - це фермент, що експресується в екзокринній підшлунковій залозі, а у деяких видів (включаючи людину) також у молочній залозі, що годує, і що виділяється з молоком. Метою цього дослідження було порівняння онтогенезу чотирьох ліпаз підшлункової залози [BSSL, тригліцериди, панкреатична ліпаза (PL), пов’язаний з панкреатичною ліпазою білок 2 (PLRP2) і фосфоліпаза A2 (PLA2)] у виду, що постачає молоко до BSSL ( миша) і той, який цього не робить (щур). Ми спостерігали за експресією чотирьох підшлункових ліпаз від постнатального d 1 до після відлучення від грудей у ​​обох видів. Ми виявили, що домінують BSSL та PLRP2, дві ліпази із широкою субстратною специфічністю. Лише після відлучення від грудей було викликано значну експресію PL і PLA2. Отже, BSSL та PLRP2, здається, відповідальні за перетравлення жирів, поки молоко є основною їжею. Крім того, ранній часовий зразок експресії BSSL відрізнявся між видами. Ми припускаємо, що BSSL молочного походження здатний компенсувати повільніший онтогенез експресії BSSL підшлункової залози у мишей.

Довіритель

Екзокринна підшлункова залоза синтезує та виділяє кілька ліполітичних ферментів, які працюють разом із шлунковою ліпазою для досягнення повного перетравлення та всмоктування харчового жиру (1). У дорослих тригліцерид-ліпаза підшлункової залози (ФЛ) є основним ферментом, відповідальним за кишкове перетравлення тригліцеридів у раціоні. Насправді, за наявності колипази та солей жовчі, було підраховано, що ФЛ становить 56% внутрішньосвітлового гідролізу тригліцеридів у раціоні у дорослих (2). PL в основному активний у три та дигліцеридах, тоді як фосфоліпаза A2 (PLA2) є основним ферментом, що бере участь у гідролізі фосфоліпідів у харчуванні у дорослих (3).

Стимульована жовчною сіллю ліпаза (BSSL) - ще один важливий фермент, який бере участь у перетравленні та засвоєнні жиру в раціоні. Подібно PLRP2, BSSL має здатність гідролізувати різноманітні субстрати, наприклад, три, ді та моногліцериди; складні ефіри холестерилу; жиророзчинні ефіри вітамінів; фосфоліпіди; галактоліпіди; і кераміди (15-17). BSSL експресується в екзокринній підшлунковій залозі у всіх видів, а у деяких видів (включаючи людей і мишей, але не у щурів), він також експресується в лактуючих молочних залозах і виділяється з молоком (18-20). Отриманий з молока BSSL суттєво сприяє ефективному використанню молочного жиру у новонароджених (1). Виснаження BSSL у генетично модифікованих мишей спричинило мальабсорбцію жиру та подальші зміни епітелію, отримані з жиру, у дистальній частині клубової кишки (21). Цікаво, що коли усиновлювачі, що експресують активний BSSL у своєму молоці, годували грудьми цуценят з дефіцитом BSSL, всмоктування жиру було відновлено до норми і кишкових уражень не виявлено.

Отже, поставляється молоко - BSSL сприяє ефективному перетравленню молочного жиру у видів, які експресують BSSL у молочних залозах під час лактації. Очевидно, цього не може бути у видів, які не виділяють BSSL з молоком. Ми припускаємо, що експресія ліпаз підшлункової залози протягом періоду лактації відрізняється між видами, які мають BSSL, що постачаються з молоком, та видами, які цього не роблять. Тому ми порівняли онтогенез ліпаз, що секретуються екзокринною підшлунковою залозою у миші, яка має BSSL в молоці, та щурів, яка цього не робить. Ми повідомляємо про суттєвий розбіжний часовий вираз, що підтверджує думку, що BSSL, поряд з PLRP2, є домінуючою ліпазою, яка бере участь у перетравленні жиру, поки молоко є основною їжею.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Процедури з тваринами.

Мишей Balb/c/Bkl та щурів Sprague-Dawley купували у Scanbur AB (Соллентуна, Швеція) та вирощували внутрішньо. Тварин утримували в приміщеннях з 12:12 год циклу світла і темряви та з необмеженим доступом до стандартної дієти R34 (Лактамін, Стокгольм, Швеція) та води. Усі процедури на тваринах були схвалені Регіональним комітетом з етики з експериментальних наук про тварин, Умео, Швеція.

У різні моменти часу, тобто в постнатальному d 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32 та у віці 6 місяців (для РНК), а також у постнатальному d 1 7, 14, 21 і 28 (для білків), щонайменше трьох мишей та трьох щурів приносили в жертву при вивиху шийки матки, а підшлункову залозу негайно обережно видаляли для виділення РНК та білків. Перед забоєм спостерігали за тваринами, коли вони їли (молоко або їжа), а потім негайно переносили в клітку без їжі (лише води) протягом 2 годин голодування.

Кількісне визначення рівнів експресії мРНК.

Повний розмір таблиці

Статистика.

Усі дані представлені як середні значення ± SEM, а всі статистичні аналізи проводились із використанням Статистичного пакету соціальних наук (SPSS). Порівняння різних засобів проводили з використанням одностороннього дисперсійного аналізу з багаторазовим порівнянням post hoc (найменша значуща різниця). Значення р

Експресія MRNA та білка панкреатичних ліпаз BSSL, PLRP2, PL та PLA2 у мишей та щурів у різному постнатальному віці. (А) Відносна кількість рівнів мРНК ліпази підшлункової залози. Стовпчики являють собою середнє значення ± SEM аналізу щонайменше трьох тварин у кожен момент часу. Для кожної проби результати нормалізували до ендогенної 18S рибосомної РНК, а значення для дорослої людини для кожної ліпази доводили до 1,0. Миша (□), щур (▪). (Б) Імуноблот. Загальні екстракти білків підшлункової залози (30 мкг/лінія; для PLA2 50 мкг/лінія) відокремлювали SDS-PAGE, переносили на мембрани PVDF і промокали антитілами, спрямованими проти ліпаз підшлункової залози, як зазначено. С, позитивний контроль.

Повнорозмірне зображення

Ранні моделі експресії BSSL у підшлунковій залозі мишей та щурів були підтверджені вестерн-ляпками (рис. 1B). Для обох видів білок BSSL був чітко виявлений через d 1. Відповідно до зареєстрованих рівнів мРНК, кількість білка BSSL у підшлунковій залозі миші зростала протягом першого тижня, досягла максимуму між d 7 і 14, а згодом вона зменшилася під час відлучення . У щурів кількість білка BSSL, що міститься в підшлунковій залозі при d 1, виявилося вищим порівняно з мишами і не змінювалось із часом від народження до відлучення. Зверніть увагу, що позитивний контроль, використаний для BSSL на малюнку 1B, був виділений з жіночого молока. Молекулярна маса BSSL відрізняється у різних видів, а фермент людини значно вищий порівняно з BSSL, виявленим у мишей та щурів (приблизно 110 кД порівняно з 70 кД).

Подібно до BSSL, виражена експресія PLRP2 була виявлена ​​в підшлунковій залозі мишей та щурів вже при d 1 (рис. 1А). У мишей рівні мРНК були постійними протягом перших 1,5 тижнів життя, але зменшувались до того часу, коли тварини починали випробовувати харчовий раціон, тобто приблизно через 12 днів. У щурів початкові високі рівні мРНК PLRP2 знижувались приблизно на d 2 або 3 після пологів до рівня, який залишався приблизно постійним до повноліття. Як у мишей, так і у щурів, кількість білка PLRP2, що міститься в підшлунковій залозі, виявилася найвищою у післяпологовому періоді d 1, після чого вона швидко знизилася до нижчого, приблизно постійного рівня (рис. 1 Б).

На відміну від BSSL та PLRP2, протягом перших 2 тижнів життя у мишей та щурів не було виявлено жодної значущої експресії PL (рис. 1А). Значні рівні мРНК PL були вперше виявлені на 16-20-му дні і досягли рівня дорослих приблизно через 1 тиждень на 28-32-й дні. Згідно з даними мРНК, білок PL не був виявлений в гомогенатах підшлункової залози, отриманих до d 21 (рис. 1 B).

Подібно PL, жодної значної експресії PLA2 не було виявлено протягом першого періоду життя у мишей або щурів. Однак час початку експресії PLA2 у підшлунковій залозі відрізнявся у різних видів. У мишей мРНК PLA2 починала збільшуватись при відлученні від грудей (d 16-20) і досягала рівня дорослих між d 28 і 32 (рис. 1А). Білок PLA2 у мишей не був виявлений у гомогенатах підшлункової залози до 28-го дня (рис. 1B). У щурів експресія підшлункової залози PLA2 почала збільшуватися приблизно на 2 тижні раніше (d 5–7; рис. 1), а білок виявляли вже через d 7 (рис. 1 B).

ОБГОВОРЕННЯ

У видів, які експресують BSSL в молочних залозах, що годують, молочний фермент є необхідною умовою ефективного перетравлення молочного жиру протягом періоду лактації (21, 25). Тому ми висуваємо гіпотезу, що експресія ендогенних ліпаз підшлункової залози протягом раннього дитинства відрізняється між видами, що мають молочний BSSL, та видами, які цього не роблять, і ми перевіряємо цю гіпотезу, порівнюючи онтогенез ліпаз. Панкреатичний у виду, який має BSSL, забезпечений молоко (миша) і те, що ні (щур).

Нещодавно було показано, що лептин, гормон, який бере участь у регуляції споживання їжі та енергетичного обміну, зменшує транскрипцію PL і PLRP1 та збільшує транскрипцію PLRP2 в екзокринній клітинній лінії підшлункової залози AR42J (30). Оскільки лептин присутній у грудному молоці (31), сироваткова концентрація у немовлят на грудному вигодовуванні вища, ніж у немовлят на штучному вигодовуванні (32), і нижча в молозиві порівняно із зрілим молоком, у якого вона зменшується з часом лактації (33). Спокусливо припустити, що висока концентрація лептину в молоці протягом початкового періоду смоктання (крім перших кількох днів) підвищує рівень лептину в сироватці крові та індукує PLRP2 та пригнічує транскрипцію PL. Однак необхідні додаткові дослідження, щоб дослідити вплив лептину на ліпази підшлункової залози in vivo та чи впливає лептин на експресію BSSL.

Наскільки нам відомо, це перший звіт, що демонструє часовий характер розвитку експресії BSSL у підшлунковій залозі мишей та щурів. Ми також підтверджуємо та розширюємо попередні дослідження на гризунах та людях, які демонструють різну тимчасову експресію PL та PLRP2 протягом періоду лактації (5-7). Наші дані чітко підтверджують і додають до попередніх висновків, що BSSL разом з PLRP2 є домінуючою ліпазою підшлункової залози протягом перших тижнів життя. Тільки до відлучення (приблизно 16-20 днів) індукується значний вираз класичних PL і PLA2. Інші дослідження будуть зосереджені на узгодженій дії ліполітичних ферментів в умовах, подібних до стану недоношених дітей in vivo. Схема вираженості розвитку, описана в цьому дослідженні, може мати важливі наслідки для дієтичної терапії недоношених дітей та новонароджених.

Глосарій

сольово-стимульована жовчна ліпаза (EC 3.1.1.3)

тригліцеридна ліпаза підшлункової залози (ЄС 3.1.1.3)