TP Вимірювання газообміну: методологія IRGA
Перш ніж вдаватися до технічних аспектів, давайте розглянемо концепцію чистого вуглецевого обміну: CO 2 У цих листках сої, які ми бачимо на фото, відбувається засвоєння CO 2 шляхом фотосинтезу (червона стрілка), а з іншого боку, викид CO 2 за допомогою таких процесів, як темне дихання та фотодихання (світло-блакитна стрілка). Між обома потоками вуглецю (асиміляція мінус викиди) встановлюється чистий обмін CO 2
Цей чистий обмін CO 2 (INC) тоді становитиме: INC (= An) = A брутто (Rd + FR) Де: - An чисте засвоєння CO 2 - брутто брутто асиміляції або загальний фотосинтез (червона стрілка діаграма) - Rd темне або мітохондріальне дихання - FR фотодихання - (Rd + FR) - це сума процесів, що виділяють CO 2 (синя стрілка на діаграмі)
An (= INC) = брутто (Rd + FR) CO 2 Біла стрілка відображає чистий потік вуглецю, в даному випадку чистий рівень асиміляції
Цей підхід можна застосувати до потоку вуглецю в інших ситуаціях INC (= An) = A брутто (Rd + FR) CO 2 INC (= An) = брутто Rd Лист рослини C 4 У цьому випадку термін FR зникає (відсутність фотодихання у рослин С 4)
CO 2 INC = Rd Гетеротрофні органи (плоди, корінь, стовбур, бульба тощо) У цих прикладах не відбувається асиміляції, і ми маємо лише як чистий потік викиди CO 2 шляхом дихання
У випадку з органами фотосинтезу INC (An) зазвичай виражається на основі площі листя та часу. Наприклад: мкмоль CO 2 м -2 с -1 (представляє, скільки CO 2 засвоюється у неттовій формі в даній області фотосинтезу та за одиницю часу) CO 2 CO 2
У випадку гетеротрофних органів INC (Rd) може бути виражений на ваговій основі (ідеально суха маса або свіжа вага), наприклад, моль CO 2 г -1 год -1 (або одиниці, такі як мкл CO 2 Kg -1 PF хв -1) CO 2 INC = Rd Гетеротрофні органи (фрукти, корінь, стовбур, бульба тощо) За домовленістю частота дихання матиме позитивний знак (хоча ми знаємо, що це втрата вуглецю для органу)
Як ми можемо виміряти обмін вуглецю? (або швидкість його асиміляції, або частота дихання залежно від випадку) Найбільш широко використовуваною методологією для вимірювання обміну СО 2 є техніка, відома як IRGA. IRGA є абревіатурою від: Інфрачервоний газовий аналізатор, тобто газовий аналізатор за допомогою ІЧ-сигналу
Методологія вимірювання газообміну за допомогою IRGA Що таке обгрунтування? Гетероатомні молекули (такі як CO 2 і H 2 O) поглинають довжини хвиль в інфрачервоному (800 нм = 0,8 мкм) Ця властивість молекул CO 2 і H 2 O використовується для кількісно визначити рівні цих газів у зразку повітря
CO 2 має пік поглинання при a = 4,25 мкм H 2 O = 2,59 мкм (мкм)
Діаграма власне IRGA - Припустимо, що газ, що містить CO 2, циркулює всередині трубки (яка є прозорою для ІЧ). - На одній стороні трубки ми маємо випромінювач ІЧ-випромінювання (наприклад, розжарену вольфрамову нитку). - ІЧ-детектор є з іншого боку протоки - Чим вищий рівень СО 2, що циркулює через трубку, тим менше сигналу реєструє ІЧ-детектор СО 2. Цей спосіб кількісного визначення аналогічний спектрофотометру (лише замість використання поглинання видимого випромінювання, це робиться в ІЧ) ІЧ-випромінювач ІЧ-детектор Насправді поглинання ІЧ-випромінювання відбувається за законом Ламберта-Біра Поглинання = C . L
1. А тепер уявіть, що ми маємо IRGA, включену в контур циркуляції газу (приводиться в дію насосом). 2. У цій системі також є водонепроникна камера (ізольована зовні і з прозорою поверхнею, що дозволяє освітлювати) і в якому розміщений лист або частина листа 3. Припустимо, що повітря потрапляє в камеру з концентрацією CO 2 = 380 ppm (нормальний атмосферний рівень) (модифіковано за Varela et al, 2000) 4. Якщо лист засвоює CO 2 методом фотосинтезу, яким буде рівень CO 2 на виході із герметичної камери? Рівний, вищий чи нижчий? 5. З різниці в мільйонних частках CO 2 на вході та на виході з камери, а також знаючи оголену площу листка та час, що минув, ми можемо дізнатись чисту швидкість асиміляції цього листа
Закрита система конфігурації Ця, яку ми щойно описали, є системою закритого типу: повітря циркулює у формі ланцюга між насосом, камерою, IRGA і т. Д. Ось такими були старіші системи IRGA. Які недоліки вони мають? - По мірі того, як повітря знову і знову циркулює по камері, рівень CO 2 знижується, і це змінює умови вимірювання. - Водночас вологість усередині камери зростає, коли лист пітніє. (Витяг з Varela et al, 2000) - Ви також можете збільшити Tº повітря та листка в камері (залежно від типу використовуваного джерела світла)
В іншому типі системи, що називається відкритою конфігурацією (односпрямований потік), паралельно є два контури, кожен із яких має власну IRGA: - опорний контур, який НЕ проходить через камеру, де знаходиться лист, - ланцюг із зразком, який проходить через камеру, де листок фотосинтезує (або дихає лише у темряві або якщо це гетеротрофний орган) Різниця в концентрації CO 2, яка реєструється між еталонним контуром та зразком, буде пропорційна фотосинтезу швидкість листка (для площі листя та часу, що враховується) З цієї причини такі типи систем називаються диференціалами
Перевага відкритих систем (порівняно із закритим типом): - Рівень СО 2 можна підтримувати постійним, без зменшень (якщо це фотосинтезуючий лист) або підвищення (якщо це гетеротрофне дихання органів) - Сучасні системи контролюють різні змінні в вимірювальна камера: - Температура (вони мають систему Пельтьє та дисипатори) - Вони можуть контролювати вологість камери (за допомогою осушувача), опромінення, яке отримує лист (світлодіоди), рівень CO 2 (інжектор із стисненим CO 2 картриджі), а іноді і рівень кисню (для цього потрібно додати пристрій, який змішує повітря з N 2. і таким чином розбавляє атмосферний O 2)
ІНФРАЧЕРВОНИЙ ГАЗОВИЙ АНАЛІЗАТОР (IRGA), що використовується в TP: CIRAS 2 (PP системи)
У ТП ми будемо використовувати відкриту систему CIRAS-2 (системи PP) Потік газу односпрямований Диференціальний режим Порівнюється CO 2 системи відліку (без аркуша) порівняно з системою аналізу (повітря, що пройшов через камеру, де він знаходиться аркуш)
Консоль CIRAS-2 з ноутбуком Всередині є IRGA, насоси, фільтри, батареї, осушувач, витратоміри тощо. Це портативна система: її можна використовувати в польових умовах в природних умовах або в посівах. Через внутрішню частину цієї сітки проходять шланги, що з'єднують затискач (камеру) з консоллю, а також електричне та інформаційне з'єднання. Затискач, камера, де розміщений аркуш або його частина (докладніше див. На наступному слайді)
У самому затискачі (на ділянці, де застряг лист) є скло, яке закриває камеру (цього не видно на фото). У цьому прикладі, коли він вимірюється штучним світлом, вище ми бачимо куб із сітка світлодіодів і, отже, верхня частина затискної камери не видно Вентилятор, що розсіює тепло Зображення затискача, що вимірює фотосинтез диких видів, в даному випадку за допомогою сонячного світла Вимірювання фотосинтезу штучним світлом Які переваги має робота з штучним світло?: - Ми можемо стати незалежними від коливань освітленості, які виникають у природних умовах і заважають вимірюванню (час доби, хмарність) (див. слайд нижче) - Однак, іноді залежно від мети дослідження, вимірювання потрібно умови на місці (природне освітлення)
Незважаючи на те, що ми не збираємося надавати технічні подробиці використання обладнання (що виходить за межі цілей дипломного курсу з фізіології рослин), ми розповімо вам деякі основні речі Трубка з поглиначем CO 2 Акумулятор частково знятий, щоб він міг слід спостерігати Трубка з абсорбентом вологи з вилученим картриджем інжектора CO 2 з кольоровим індикатором. Це вид ззаду консолі, де ви можете побачити трубки з осушувачем (подібний силікагель) та абсорбентом CO 2 (содалім). Ці трубки вставляються в газовий контур обладнання та регулюють рівень вологості та рівня CO 2 у вимірювальній камері відповідно до того, що вирішить користувач. Також спостерігаються знімні батареї та інжектор CO 2 (із картриджем, стисненим зразком CO2 ) У наступному посиланні на youtube ви можете побачити відео про CIRAS 3 (більш сучасна модель). Тим, хто не розуміє англійської, все одно допомагає побачити різні особливості цього типу обладнання https://www.youtube.com/watch?v=wyacotzpody
Деякі міркування. 1. Слід пам’ятати, що An - параметр на рівні листків. 2. Чистий коефіцієнт асиміляції до насиченості світлом (A sat) є мірою фотосинтетичної здатності (An in situ) 3. Ан виражається в одиницях Площа листя (отже, залежить від товщини листка) 4. Стандартизація типу листа та часу вимірювань 5. Точкові вимірювання проти. Криві відповіді Давайте трохи проаналізуємо ці питання
1. Слід пам’ятати, що отримане нами значення An є параметром на рівні листків. Припустимо, ми затискаємо цей сектор 2-го листка цієї рослини (кругова область пунктиром): 1. Чиста швидкість асиміляції, яку ми будемо одержувати не обов’язково те саме, що й у інших листя (з різним рівнем азоту, онтогенезу, експозиції тощо) 2. Асиміляція всієї рослини буде відрізнятися від асиміляції окремого листа, оскільки вуглецевий обмін інших органів не входить (наприклад, дихання стебла, стан)
2. Швидкість чистої асиміляції до насичення світлом (A sat) є мірою фотосинтетичної здатності (An in situ). Продовжуючи попередній приклад . - Якщо ми вимірюємо з опроміненням, яке насичує фотосинтез (наприклад, 1000 мкмоль фотони м -2 с -1 для рослини C 3), отримане нами значення An буде його фотосинтетичною здатністю (тобто максимально можливим для An). - Значення, яке An фактично має in situ, буде залежати від умов (наприклад, світла), які має клинок у будь-який час. Залежно від мети дослідження, професіонал вимірюватиме An з реальними умовами in situ, або з опроміненням при насиченні світлом
3. Ан виражається в одиницях площі листа (отже, під впливом товщини листа) Давайте розберемо це в 3D. Порівняємо ці дві ситуації, два листки з чітко різною товщиною: - Кількість фотосинтетичної тканини, яка буде затиснута вимірювальна камера (коло і пунктирними лініями вертикальна проекція розглянутої площі) буде дуже різною, незважаючи на те, що обидва однакові площі. Якщо порівнювані листки мають різну товщину (тобто різну питому площу листя), зручно виразити оцінюйте фотосинтез НЕ на основі площі, а на основі одиниці сухої маси (так що кількість фотосинтетичної тканини в обох випадках є порівнянним)
4. Стандартизація типу аркуша та графік вимірювань Ми повинні порівнювати еквівалентні органи. На прикладі попередніх слайдів, якщо у сорту ми вивчаємо 2-й. листя, в іншому сорту ми будемо вимірювати такий же тип листя. У випадках, коли ця стандартизація є більш складною, критерієм, який використовується багато разів, є вимірювання наймолодшого листа, повністю розширеного. вимірювання о 16:00) Зазвичай вони використовують центральну смугу дня (наприклад, з 11:00 до 15:00). Читаючи це, деякі з вас, напевно, думають, що якщо у мене штучне світло зі світлодіодами, мені все одно щодо розкладу. Що ви думаєте? cri cri cri Однак це МОЖЕ мати значення, оскільки деякі види мають ендогенні циркадні ритми (внутрішні ритми рослини з циклом приблизно один день) у поведінці своїх продихів. У деяких випадках це може бути проблемою, і вам доведеться встановити графік вирішення цієї проблеми.
5. Конкретні заходи проти. Криві відповіді Точкові вимірювання: швидкість фотосинтезу вимірюється при певній освітленості (наприклад, якщо ми хочемо порівняти фотосинтетичну здатність двох сортів культури, ми проведемо n вимірювань при насичувальній освітленості у сорту А та n вимірювань у сорту В ) Відповідь кривих: реакція фотосинтезу на зміни таких змінних, як опромінення або CO 2, вимірюється на одному аркуші (з цими кривими отримують різну інформацію; див. Нижче) 8 6 A sat An (моль CO 2 м -2 с - 1) 4 2 0 ПК світло -2 R n нахил = Квантовий вихід фотосинтезу (CO2) 0 200 400 600 800 Інцидент PPFD (моль фотонів м -2 с -1)
На даний момент ми зупинимося на кривих реакції фотосинтезу на опромінення 8 A sat Фотосинтетична ємність 6 An (моль CO 2 м -2 с -1) 4 2 Узагальнена крива швидкості фотосинтезу на опромінення (PPFD) 0-2 R n легкий нахил ПК = Квантовий вихід фотосинтезу (CO2) 0 200 400 600 800 Інцидент PPFD (моль фотонів м -2 с -1) (витягнуто з Tambussi and Graciano 2010)
У ТП ми побудуємо криві реакції А на опромінення в 3 типах листків: - верхівковий лист (піддається сильному опроміненню) сої Glycine max C 3 - базальний лист сої (затінений) - лист сорго Алеппо. бур'ян C 4 8 З кожної кривої ми можемо отримати: 6 A sat - Темп темпу дихання - CP світла (опромінення, де An = 0) - Фотосинтетичну здатність (A sat) і освітленість насичення An (моль CO 2 м - 2 с -1) 4 2 0-2 R n легкий ПК Нахил = Квантовий вихід фотосинтезу (CO2) 0 200 400 600 800 Інцидент PPFD (моль фотонів м -2 с -1)
Результати An (мкмоль CO 2 м -2 с -1) PPFD Апікальна соя Базальна соя Сорго мкмолів фотонів м -2 с -1 Алеппо 0-1,6-0,8-1,55 50 0,3 0,7- 0,50 100 2,3 2,6 1,5 200 5,6 6,0 4,3 350 8,5 6,9 8,6 500 12,2 7,5 14,0 700 14,5 7,9 17,0 1000 15,7 7,8 22,0 1500 15,4 7,9 27,0 2000 15,5 7,75 35,6
1. Криві можна зобразити за допомогою електронної таблиці (Excel) 2. Освітлювальний ПК можна отримати, використовуючи лише значення лінійного сектора кривої (наприклад, перші 5 значень, до незначних ірисацій): Вони отримують рівняння лінії (An як функція опромінення), а потім вони вирішують для змінної x значення змінної y (тобто An) = 0 3. Фотосинтетична ємність та опромінення (PPFD) насичення можуть бути отримано графічно шляхом спостереження кожної кривої (червоні пунктирні лінії на графіку) An (моль CO 2 м -2 с -1) 8 6 4 2 0 ПК світло A sat -2 R n Нахил = Квантовий вихід фотосинтезу (CO2) 0 200 400 600 800 Інцидент PPFD (моль фотонів м -2 с -1)
Кілька питань, які допоможуть вам у дискусії та інтерпретації результатів: a. Порівняйте вигини трьох типів листя. Які відмінності ви бачите? (зосередьтеся на параметрах, описаних вище, світловий КП, дихання, A sat, освітленість насиченості тощо) b. Поясніть з біохімічної та фізіологічної точок зору відмінності, що спостерігались у попередньому питанні (не постулюйте аргументи типу, оскільки він пристосований або акліматизований до цього стану. Сформулюйте механістичні пояснення). c. Яке біологічне значення світла для ПК? Тобто, яке значення має для балансу С аркуш?
На додаток до описаних вище дій, дайте відповіді на наступні запитання: 1. Світлодіоди, що використовуються як штучне джерело світла в цьому обладнанні, є червоним і синім: як ви думаєте, чому виробники обрали саме ці кольори? Обґрунтуйте. 2. Чому буде важливо контролювати змінні в камері, де затискається лезо, весь час, протягом якого триває вимірювання? Подумайте, на що, наприклад, може вплинути зміна температури. 3. Перш ніж ми сказали вам, що IRGA, крім вимірювання чистої зміни СО 2, можуть кількісно оцінити зміни рівнів H 2 O. Для чого це може бути? Іншими словами, який ще фізіологічний процес можна виміряти? 4. Припустимо, ви хочете виміряти швидкість фотосинтезу листа, який раніше був у темряві. Чи можуть вони затиснути лезо в обладнанні, увімкнути світлодіоди та негайно виміряти А? Обґрунтувати у фізіологічному та біохімічному контексті. Складіть звіт щодо цієї частини ТП, включаючи перелічені вище питання. Не забудьте надіслати звіт викладачу, відповідальному за вашу комісію, електронною поштою.
Додаток: згадка деяких застосувань методології IRGA Потоки СО 2 в екосистемах Зондування СО 2 в камерах після збору врожаю (коваріація Едді): використовується для аналізу того, наскільки вуглець фіксує екосистему (наприклад, ліс, джунглі) Дихання гетеротрофних тканин (наприклад, стовбури) Специфічні вимірювання кривих фотосинтезу та реакції: використовуються в екофізіологічних дослідженнях для поліпшення врожаю Дихання ґрунтових мікроорганізмів