реферат

Ця робота представляє прямі докази того, що ген bcl-2 транскрипційно регулюється ядерним фактором -B (NF-κB) і безпосередньо пов'язує сигнальний шлях TNF-α/NF-κB з експресією Bcl-2 та його реакцією на виживання людини. клітини раку простати. Сліди DNase I, затримка гелю та аналіз суперзсуву виявили сайт NF-κB в промоторі bcl-2 β2. У контексті мінімального промотору цей bcl-2 p2-сайт 1 збільшив транскрипцію в 10 разів у присутності векторів експресії p50/p65, порівнянно із збільшенням, яке спостерігається на консенсусному сайті NF-κB, тоді як для повного промотору p2, активність транскрипційної області в регіоні збільшилася в 6 разів надмірно експресія NF-κB, ефект, усунутий мутацією сайту bcl-2 p2 1. Експресія Bcl-2 асоціювалася з гормонорезистентним фенотипом запущеного раку передміхурової залози. Тут ми показали, що підвищення рівня експресії Bcl-2 у клітинній лінії раку простати людини LNCaP, яке спостерігається у відповідь на відміну гормону, додатково посилюється лікуванням TNF-α, і цей ефект послаблюється інгібіторами NF-κB. У той же час дослідження промоторів bcl-2 β2 в клітинах LNCaP показують 40-кратне збільшення активності промотору після стимуляції TNF-α за відсутності гормону.

Протягом останніх кількох років з'являється все більше доказів того, що шляхи передачі сигналів апоптозу залучені до багатьох захворювань, включаючи рак. Ключовим гравцем апоптозу є сімейство білків Bcl-2, які можна розділити на антиапоптоз (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, A1 та Mcl-1) або проапоптоз (Bax, Bid, Bad, Bak, Bic, Bok, Bcl-XS та Hrk) (розглянуто в Gross et al., 1999). Багато досліджень свідчать про те, що відносні рівні цих проапоптотичних та антиапоптотичних білків у клітині визначають, чи клітина живе чи гине у відповідь на апоптотичну сигналізацію (Oltvai et al., 1993; Oltvai and Korsmeyer, 1994). Точний спосіб, яким Bcl-2 забезпечує захист від апоптозу, досі незрозумілий; однак вважається, що він прямо чи опосередковано запобігає вивільненню цитохрому c з мітохондрій, що, у свою чергу, перешкоджає активації Apaf-1 та нижчих каспаз (Zou et al., 1997).

Стіл в натуральну величину

Недавні дослідження пов’язували експресію Bcl-2 з розвитком гормонорезистентного фенотипу запущеного раку простати (Colombel et al., 1993; McDonnell et al., 1992; Raffo et al., 1995). Також тепер виявляється, що експресія Bcl-2 може захистити клітини раку простати від багатьох різних апоптотичних подразників, таких як абляція гормонами, променева терапія та хіміотерапія, включаючи лікування TNFα (Apakama et al., 1996; Chaudhary et al., 1999; Huang and та ін., 1998, Mackey та ін., 1998). Дослідження, що вивчають взаємозв'язок між Bcl-2 і NF-κB у регуляції індукованого TNF-α апоптозу в клітинах раку простати, виявили, що інгібування експорту ядер NF-κB домінантно-негативними мутантними клітинами IκB до індукованих TNF-α апоптоз та екзогенна надмірна експресія Bcl-β 2 ефективно блокували цей ефект (Herrmann et al., 1997). У цьому дослідженні ми досліджуємо регуляцію транскрипції bcl-2 за допомогою NF-κB та його значення для ендогенної експресії Bcl-2 у клітинах раку передміхурової залози людини після впливу TNF-α.

результат

Ідентифікація сайтів зв’язування фактора транскрипції NF-κB в промоторі bcl-2 p2 за допомогою рекомбінантного NF-κB1

Розташування ділянок (ів) зв'язування фактора транскрипції NF-κB в областях промотору bcl-2 було визначено за допомогою аналізу слідів DNase I із використанням очищеного рекомбінантного білка p50 (NF-κB1) (рис. 1). Захист чітко спостерігався в одній області (ділянка 1) промотору bcl-2 p2 (малюнок 1, смуга 2), і відповідно до цього спостереження було встановлено, що послідовність цієї області містить елемент із 80% ідентичністю з NF- консенсусна послідовність κB (таблиця 1).). Також було виявлено менш переконливий другий сайт (сайт а), але в цьому регіоні було виявлено лише погану згоду з послідовністю консенсусу (Таблиця 1, що називається сайтом 2). В області промотору bcl-2 p1 слідів не спостерігалось (дані не наведені).

bcl-2

Аналіз DNase I промотору bcl-2 β2 з рекомбінантним білком NF-κB. 5 'мічений кінцевий фрагмент p2 ДНК інкубували у відсутності (смуга 1) або у присутності рекомбінантного p50 (смуга 2) перед розщепленням ДНКази. Непов'язана послідовність ДНК (маркери) прилягає до смуги 1 і використовувалась для визначення ділянок 1 та ділянки NF-κB. стопи. Стрілки вказують розташування заповідних регіонів. На авторадіограмі показано один репрезентативний експеримент

Повнорозмірне зображення

Затримка гелю та комплексний аналіз суперзсуву регуляторних областей промотору bcl-2 p2 з рекомбінантним білком NF-KB1. Аналізували 33 мічені Р-дволанцюгові олігонуклеотидні зонди bcl-2 p2 сайт 1 (доріжки 4 та 5), ділянку 2 (доріжки 6 та 7) та консенсус NF-κB (доріжки 1, 2, 3, 8 та 9). за їх здатність утворювати гель-ретардаційні та суперзсувні комплекси з рекомбінантним p50. Кролячі антитіла проти p50 (Calbiochem-Novabiochem Corp.) інкубували з аналізованим екстрактом, як зазначено. Немечену консенсусну послідовність NF-κB дволанцюгового олігонуклеотиду використовували як конкурента в доріжці 1, а в доріжках 8 і 9 додавали не пов'язаний немічений конкурентний ядерний фактор конкуренції гепатоцитів (HNF-3), щоб продемонструвати специфічність спостережуваний комплекс. Двоцепочечний консенсус послідовності, позначений елементом відповіді на cAMP (CRE), також використовувався для перевірки специфічності взаємодії. На авторадіограмі показано один репрезентативний експеримент

Повнорозмірне зображення

Характеристика білків, що зв'язують ДНК, у екстрактах ядерних клітин з оброблених TNF-α клітин LNCaP або WEHI 231, які взаємодіють із передбачуваним сайтом зв'язування bF1-2 p2 промотору NF-κB.

Повнорозмірне зображення

Не спостерігалося ніяких надзміщених комплексів з нерелевантними антитілами проти sp1 (дані не наведені). Таким чином, цей суперзсутовий аналіз з антитілами проти p65 та anti-p50 надає додаткові фізичні докази того, що bcl-2 p2 сайт 1 насправді пов'язує комплекси NF-κB.

Трансактивація транскрипції NF-κB з промотору bcl-2 p2 опосередковується сайтом bcl-2 p2

Функціональний аналіз передбачуваних сайтів bcl-2 p2 промотору NF-kB в контексті мінімального промотору. Розглянуті конструкції містять консенсусну послідовність NF-κB (KB), bcl-2 p2-сайт 1 (сайт 1) та bcl-2 p2-сайт2 (сайт 2) дволанцюжкові олігонуклеотиди, клоновані в мінімальну промоторну конструкцію pTATA (див. Схему). зверху). Номер копії олігонуклеотиду в конструкції вказується в дужках в назві конструкцій. Відносну активність конструкцій у клітинах Hela S3 досліджували за наявності (+) та відсутності (-) екзогенно експресованих p50/p65 (NF-κB), використовуючи вектори експресії pCMVp50 та pCMVp65. Повідомляється про транскрипційні дії порівняно з конструкцією pNF-κB (2) у присутності NF-κB, який позначається рецептором з відносною активністю 1,0. PRL-TK використовували для корекції ефективності трансфекції. Ці результати є середнім значенням для трьох окремих експериментів, а стовпчики помилок вказують на стандартне відхилення

Повнорозмірне зображення

Трансактивація транскрипції з промотору bcl-2 p2 за допомогою NF-κB та скасування цього ефекту шляхом сайт-спрямованого мутагенезу передбачуваного сайту 1. Конструкції p2LUC містять послідовність промотора bcl-2 p2 від -754 до +1, розташовану безпосередньо вгору до гена промотору люциферази, вільного від 5 ′ (LUC) у pbasic (Promega), такий що промотор bcl-2 p2 спрямовує експресію гена LUC. Плазміди p2M1LUC та p2M2LUC, що містять мутовані ділянки 1 або 2, генерували з p2LUC, використовуючи набір для мутагенезу, спрямований на сайт GeneEditor (Promega). Відносну активність конструкцій у клітинах Hela S3 досліджували за наявності (+) та відсутності (-) екзогенно експресованого p50/p65, використовуючи вектори експресії pCMVp50 та pCMVp65. Повідомляється про транскрипційні дії у порівнянні з конструкцією p2LUC за відсутності NF-κB, яка, як вказується, має відносну активність 1,0. PRL-TK використовували для корекції ефективності трансфекції. Ці результати є середнім показником чотирьох окремих експериментів, а стовпчики помилок вказують на стандартне відхилення

Повнорозмірне зображення

Лікування TNF-α та експресія Bcl-2 у клітинах LNCaP раку передміхурової залози

Підвищена експресія Bcl-2 у відповідь на поглинання гормонів ще більше збільшується у присутності TNF-α. Клітини раку передміхурової залози людини LNCaP культивували в середовищі, що містить 10% сироватки, виснаженої активованим вугіллям, у присутності (+ H) або відсутності гормону (-H) (0,5 нМ 6α-фтортестостерон) протягом ночі перед додаванням NF-κB та/або Інгібітори TNF-β. A. Інгібітори (Bay 11-7082 [10 мкМ] та проникний для клітин NF-κB інгібуючий пептид [100 мг/мл]) або проникний для клітин NF-κB контрольний пептид [100 мг/мл] інкубували з клітинами протягом 15 днів. хв. при 37 ° C перед додаванням TNF-α (10 нг/мл). Потім інкубацію при 37 ° C продовжували ще протягом 6 годин до лізису клітин та аналізу білка (100 мкг) шляхом імуноблотингу проти Bcl-2. Те саме навантаження було підтверджено розчином Понсо S (Sigma Chemical Co) фарбуванням

Повнорозмірне зображення

Трансактивація транскрипції з промотору bcl-2 p2 у клітинах LNCaP у відповідь на відміну гормону та стимуляцію TNF-α

Для дослідження впливу відміни гормону та стимуляції TNF-α на активність промотору bcl-2 p2 в клітинах LNCaP проводили експерименти з перехідною трансфекцією, використовуючи конструкцію промотора p2 (p2LUC), яка містить промотор bcl-2 p2 у повній довжині перед потоком ген люциферази слизової (фігура 7А). Транскрипційні дії порівнюють з конструкцією p2LUC за відсутності TNF-α (-TNF-α) та присутності гормону (+ гормон), який позначається як рецептор з відносною активністю 1,0.

Повнорозмірне зображення

Встановлено, що поглинання гормону збільшує транскрипційну активність промотору β2 у 8 разів, а лікування TNF-α за відсутності гормону різко посилює активність промотору, у 40 разів більше p2LUC за відсутності TNF-α та у присутності гормону. (Вектор pbasic контролю демонстрував незначну активність за будь-яких умов). Ці результати підтверджують результати, отримані для експресії білка Bcl-2 у клітинах LNCaP. Для подальшої демонстрації того, що трансактивація транскрипції з промотору bcl-2 p2 у клітинах LNCaP у відповідь на поглинання гормону та стимуляцію TNF-α опосередковується NF-κB, транскрипційну активність промотору bcl-2 p2 оцінювали за цих умов . і після спільної трансфекції клітин LNCaP з домінуючою негативною конструкцією pCMV IκB (Біотехнологія Upstate). Цей вектор виражає нефосфорильований, не розкладається IκB (Малюнок 7B). Результати, про які повідомляється тут, показують, що трансактивація промотору bcl-2 β2 у TNF-α-активованих клітинах LNCaP інгібується шляхом абляції сигналів NF-κB. У сукупності ці дані свідчать про переважну роль шляху TNF-α/NF-κB у транскрипційній регуляції bcl-2 у клітинах раку передміхурової залози через промотор p2.

$ config [ads_text16] не знайдено

обговорення

Матеріали і методи

Культура клітин, трансфекція та аналіз люциферази

Незріла В-клітинна лінія, WEHI 231, і клітинна лінія карциноми шийки матки людини, Hela S3 (ATCC), підтримувались у модифікованому Дульбекко середовищі Eagle (DMEM), доповненому 10% фетальної телячої сироватки та 0,45% глюкози (Gibco Laboratories). при 37 ° C у 5% CO 2/повітря. Клітини WEHI 231 доповнювали 50 мкМ β-меркаптоетанолом, як описано в інших місцях (McCormack et al., 1984). Перед лікуванням клітини WEHI 231 розбавляли до щільності 3,5 х 105 клітин/мл свіжим середовищем та інкубували протягом 5 годин. Клітинна лінія раку передміхурової залози людини LNCaP-FGC (ATCC), іменована в цьому звіті як LNCaP, культивується в RPMI-1640, доповненій 10% фетальною бичачою сироваткою або фетальною фетальною бичачою сироваткою (Gemini Bioproducts), яка містить 10 % фетальної бичачої сироватки. 50 одиниць/мл пеніциліну та 50 мкг/мл стрептоміцину.

Трансфекцію проводили в 6-лункових планшетах, як описано вище (Graham and van der Eb, 1973; Sorge et al., 1984). Трансфікована ДНК-суміш містила 5 мкг плазміди LUC кімнатної мухи (див. Розділ про клонування та мутагенез нижче) та 250 нг pRL-Tk (Promega), який служив внутрішнім контролем ефективності трансфекції. pRL-TK контролює експресію гена люциферази ренілли (RL), використовуючи промотор тимідинкінази вірусу простого герпесу. За необхідності, суміш ДНК також містила 100-250 нг векторів експресії NF-κB (pCMV-p50 та pCMV-p65), контрольний вектор pCMV-PA (щедрий подарунок від LR Faust) або домінантну негативну кДНК pUSE-IκB до IκB (S32A/S36A) (Біотехнологія штату штат). Клітинні екстракти готували через 48 годин після трансфекції та аналізували активність люциферази сарани та ренілярної люциферази за допомогою набору stop and glo (Promega) відповідно до інструкцій виробника.

Клонування та мутагенез

Екстракти з ядер і цілих клітин

Ядерні екстракти готували з LNCaP або WEHI 231, по суті, як описано (Prösch et al., 2000). Клітини обробляли TNF-α (50 нг/мл) (Sigma) протягом 2 годин при 37 ° С протягом ночі перед приготуванням екстрактів. Екстракти клітин LNCaP готували по суті, як описано в інших місцях (Miyake et al., 1998). Для аналізу експресії Bcl-2 клітини інкубували в середовищі, що містить 10% сироватки, виснаженої активованим вугіллям, у присутності або відсутності гормону (0,5 нМ 6α-фтортестостерон) протягом ночі перед додаванням інгібіторів NF-κB та/або TNF-α. Інгібітори (інгібуючий пептид Bay 11-7082 або NF-κB) або контрольний пептид (усі від Biomol) інкубували з клітинами протягом 15 хвилин при 37 ° C перед додаванням TNF-α (10 нг/мл). Потім інкубацію при 37 ° С продовжували ще протягом 6 год, потім клітини лізували та аналізували за допомогою імуноблотингу.

Імуноблот-аналіз

Експресія Bcl-2 досліджувалась, як і в інших місцях (Miyake et al., 1998). Зразки, що містять 100 мкг білка, піддавали SDS-PAGE і переносили на нітроцелюлозну мембрану. Фільтри блокували в PBS, що містить 5% сухого знежиреного молока при кімнатній температурі протягом 1 години, а потім інкубували протягом 3 годин при кімнатній температурі з розведенням моноклональних антитіл миші anti-bcl-2 1: 100 (Санта-Крус, Каліфорнія, США). Потім мембрани інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з кон’югованою з лужною фосфатазою анти-мишачими антитілами IgG (Caltag), а специфічні білки візуалізували за допомогою колориметричної системи (BCIP/NBT) відповідно до інструкцій виробника (Biorad). Те саме навантаження було підтверджено фарбуванням Ponceau S (Sigma Chemical Co., Сент-Луїс, Міссурі, США).

Структура DNase I, зсув гелю з електромобільністю та тести на суперзсув

Реакції слідів з ДНКазою I проводили, як було описано раніше (Briggs et al., 1986; Johnson et al., 1995). Реакції містили 1-5 нг кінцево міченого фрагмента ДНК у 100 мкл реакційної суміші, що містить 10 мМ трис-гідрохлориду (рН 7,9), 50 мМ KCl, 0,5 мМ ЕДТА, 1 м М ДТТ, 0,5 м М PMSF., 10 % (об/об) гліцерину, 1 мкг полі [d (IC)] та очищений p50 (Promega). Зв'язування проводили протягом 15 хвилин при 0 ° C, потім 2 хвилини, а потім припиняли додаванням 100 мкл 1% (мас./Об.) NaDodSO 4, 20 мМ EDTA, 200 мМ NaCl, що містить 250 мкг/мл. тРНК. Потім суміш екстрагували фенолом, етанол осаджували і аналізували за допомогою електрофорезу 6% сечовини-акриламідного гелю та авторадиографії.

Дякую

Цю роботу частково підтримали грант USPHS AI-44434, Фонд Штейна та Освітній грант Skaggs. Ми хотіли б подякувати Джулії М Рудіа за технічну допомогу та Керол Федоришин за допомогу у підготовці цього рукопису. PC Atterton надавав технічні послуги з написання.