язані

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • Матеріали і методи
  • результат
  • Звіт про справу
  • Повне секвенування exom визначає варіанти в NDUFAF4
  • Варіант NDUFAF4 призводить до ізольованого дефіциту ДІ, який можна врятувати за допомогою лентивірусної комплементації диким типом NDUFAF4.
  • Дефіцит ДІ у фібробластах з дефіцитом NDUFAF4 спричинює змінену суперкомплексну стехіометрію
  • Дефіцит NDUFAF4 призводить до накопичення проміжних сполук CI, що містять компоненти проксимального P-модуля, дистального P-модуля та N-модуля
  • обговорення
  • Додаткова інформація
  • Документи Word
  • Додаткова інформація
  • Файли зображень
  • Додаткова фігура 1
  • Додатковий малюнок 2
  • Додатковий малюнок 3

предметів

  • Генетика хвороб
  • Порушення обміну речовин

реферат

Мітохондріальний дихальний комплекс I складається з 44 різних субодиниць і може бути розділений на три функціональні модулі: Q-, P- та N-модуль. NDUFAF4 (C6ORF66) - це складний фактор складання I, який пов'язаний з проміжними проміжними елементами збірки Q-модуля. Шляхом секвенування екзоми ми виявили варіант гомозиготного міссенсу у складного I-дефіцитного пацієнта з синдромом Лі. Суперкомплексний аналіз фібробластів пацієнта виявив специфічно змінену стехіометрію. Детальний аналіз складання комплексу I із зазначенням усіх шляхів його складання показав накопичення частин P- та N-модуля, але не Q-модуля. Лентивірусна комплементація хворих на фібробласти з диким типом NDUFAF4 врятувала дефіцит комплексу I та порушення збірки, підтверджуючи причинну роль варіанту. Наш звіт про другу родину, уражену варіантом NDUFAF4, додатково характеризує фенотиповий спектр та проливає світло на роль NDUFAF4 у біогенезі мітохондріального комплексу I.

Мітохондріальний дихальний ланцюг I (CI, NADH: убихінон оксидоредуктаза) є найбільшим компонентом системи окисного фосфорилювання (OXPHOS). Він має Г-подібну форму і може бути розділений на три функціональні модулі: Q-модуль (редукція убихінону) та N-модуль (дегідрогеназа NADH), які утворюють матричний рукав, та Р-модуль (протонна накачка), які утворюють мембрану- інтегрована рука.

Біогенез CI є складним процесом: 37 кодованих ядром та 7 кодованих мітохондріями субодиниць утворюють ряд проміжних сполучних елементів, які збираються в кілька паралельних та послідовних етапів, щоб сформувати повністю зібраний комплекс. Згодом CI інтегрується в суперкомплекси, в яких він асоціюється або з комплексом III (CIII) -димером (I/III 2 -суперкомплекси), або з CIII-димером та однією або декількома копіями комплексу IV (CIV, I/III 2/IV n - комплекси комплексів). 1

Збірка CI залежить від дії кількох факторів складання, які пов'язані з проміжними проміжними елементами, але не є частиною самого голоферменту.

NDUFAF4 (C6ORF66) класифікується як фактор складання Q-модуля, оскільки він асоціюється з підсборками Q-модуля під час біогенезу. 1 Однак його точна функція ще не з'ясована. На сьогоднішній день описано один варіант NDUFAF4 в одній родині, який впливав на функцію білка. 2 Тут ми представляємо пацієнту новий варіант NDUFAF4, розширюємо фенотип, пов’язаний з дефіцитом NDUFAF4, та аналізуємо його роль у біогенезі КІ.

Матеріали і методи

Дивіться додаткову інформацію в Інтернеті.

результат

Звіт про справу

Пацієнт є першою дитиною вцілілих (первородних братів) батьків пакистанської етнічної групи. Він народився на 38 тижні вагітності після індукції пологів через побоювання щодо затримки внутрішньоутробного розвитку. Він важив 2406 г.

У віці 7 місяців його познайомили з місцевими педіатричними службами, щоб зменшити свої віхи. Він рідко посміхався, не міг перекинутися, сидів без підтримки і не посміхався. Він був недисморфічною дитиною з надмірною вагою та дратівливістю. У нього була центральна гіпотонія та нормальний до трохи підвищений тонус кінцівки з легко викликаними сухожильними рефлексами та відсутність клону.

МРТ головного мозку виявила дифузні двосторонні зміни сигналу в базальних гангліях і таламусі, що свідчить про синдром Лі. ЕЕГ показала загальне уповільнення з мультифокальними спайками, що узгоджується з епілептогенним націлюванням. Серцево-судинних, ниркових та печінкових захворювань не було.

Аналіз органічних кислот у сечі виявив збільшення метаболітів лактату, кетонів та циклу Кребса. Лактат плазми становив 10,6 ммоль/л, а лактат ліквору - 6,1 ммоль/л (контрольний діапазон: 0,8-1,8 ммоль/л). Отримані пацієнтом фібробласти шкіри досліджували на активність ферменту дихального ланцюга, який виявляв ізольований дефіцит ДІ (32 мО/U цитрат-синтази, контрольний діапазон: 163-599) з активністю комплексів II, III, IV та V в межах еталонного діапазону.

Через два роки після первинного обстеження у пацієнта все ще спостерігається глибока затримка розвитку, необхідне годування з ПЕГ зондом і у нього епізодичні напади.

Повне секвенування exom визначає варіанти в NDUFAF4

Гомозиготний варіант міссенсу в гені NDUFAF4 (NM_014165.3) був ідентифікований шляхом секвенування ексом: c.7G> C; стор. (Ala3Pro). Цей варіант не зустрічається ні в базі даних ExAC (//exac.broadinstitute.org), ні в базі даних 1000 геномів (//www.internationalgenome.org), ні у нашій внутрішній базі даних. Новий варіант та раніше опублікований варіант були завантажені до "Бази даних відкритих варіацій Лейдена" (//www.lovd.nl/NDUFAF4): ідентифікатори варіантів # 0000170856 та # 0000174214; індивідуальні ідентифікаційні номери # 00104960 та # 00107834.

Варіантне програмне забезпечення для прогнозування передбачає різні функціональні ефекти цієї мутації: Дегустація мутатора (//www.mutationtaster.org/): 3 «поліморфізм» (ймовірність: 0,84); PolyPhen-2 (//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/): 4 "ймовірно шкідливий" (оцінка: 0, 991); SIFT (//sift.jcvi.org/): 5 "шкідливих" (оцінка SIFT 0,04). Вирівнювання послідовності показало, що обмінний аланін у положенні 3 амінокислотної послідовності зберігається у ссавців (додаткова фігура 1).

Варіант NDUFAF4 призводить до ізольованого дефіциту ДІ, який можна врятувати за допомогою лентивірусної комплементації диким типом NDUFAF4.

Комплементацію лективірусу з міченим С-кінцем V5 міченим диким типом NDUFAF4 проводили, щоб продемонструвати, що варіант NDUFAF4 впливає на функцію білка (рис. 1). Ферментативна активність CI була врятована шляхом комплементації з NDUFAF4, але не шляхом модельованої трансфекції міченим V5 GFP (рис. 1а). Комплементація також врятувала знижені рівні голо-Cl, проаналізовані за допомогою електрофорезу нативного синього поліакриламідного гелю (BN-PAGE)/імуноблотингу з використанням мітохондріального білка 1-додецил-β-D-мальтозиду (рис. 1b). Рівні субодиниць ДІ, аналізовані електрофорезом у поліакриламідному гелі додецилсульфату натрію (SDS-PAGE), також збільшувались у доповнених фібробластами пацієнта (рис. 1в). NDUFAF4 не виявлявся в клітинах пацієнта.

Повнорозмірне зображення

Дефіцит ДІ у фібробластах з дефіцитом NDUFAF4 спричинює змінену суперкомплексну стехіометрію

Оскільки CI утворює суперкомплекси з CIII та CIV, а рівні останніх двох не змінювались, незважаючи на відсутність CI, ми проаналізували суперкомплексну стехіометрію. Для збереження суперкомплексних взаємодій білок мітохондрій розчиняли м'яким детергентом дигітоніном, а не n-ододецил-β-D-мальтозидом, і піддавали BN-PAGE/імуноблотингу. У разі NDUFAF4-дефіцитних фібробластів відсутність CI призвела до зменшення I-III 2- та I/III/IV n-суперкомплексів (рис. 2a-c) із підвищеним рівнем димерів CIII та III 2/IV . -суперкомплекси (малюнки 2b та c). Примітно, що мономерні рівні CIV залишились незмінними (рис. 2в).

Повнорозмірне зображення

Дефіцит NDUFAF4 призводить до накопичення проміжних сполук CI, що містять компоненти проксимального P-модуля, дистального P-модуля та N-модуля

Ми проаналізували вплив дефіциту NDUFAF4 на складання CI шляхом експериментів 2D-BN-PAGE/SDS-PAGE у фібробластах пацієнта (рис. 3). У першому вимірі BN-PAGE виділяють природні білкові комплекси (тобто комплекси OXPHOS) (Рисунок 1b). Етап SDS-PAGE другого виміру дозволяє розділити та покращити доступність епітопу для імунодетекції окремих компонентів цих природних білкових комплексів, включаючи проміжні сполуки CI. У цих експериментах ми використовували антитіла, спрямовані проти репрезентативних компонентів складових проміжних продуктів усіх функціональних модулів, а отже, і проти всіх шляхів складання CI (додаткова фігура 2). Підвузли Q-модуля, що містять NDUFAF4 або NDUFS3, більше не були виявлені у фібробластах пацієнта і не накопичувались. Однак було чітке накопичення проксимальних підсборок P-модуля, що містять фактори складання ACAD9 та ECSIT, дистальних підсборів P-модулів, що містять субодиницю CI NDUFB11, та підвузлів N-модулів, що містять субодиницю NDUFV2 CI. Ці дефекти в наборі були врятовані у фібробластах пацієнта, доповнених NDUFAF4 дикого типу.

Повнорозмірне зображення

NDUFAF4 тісно пов'язаний з NDUFAF3, 1, 6, ще одним фактором складання CI, відсутність якого призводить до подібної помилки складання. 7 Оскільки вважається, що NDUFAF3 бере участь у введенні мембрани субодиниць β-модуля, 6 ми проаналізували розподіл кількох субодиниць CI у мітохондріальних фракціях розчинного білка та мембранних білкових фракціях фібробластів пацієнта (Додаткова фігура 3). У контрольних та фібробластів пацієнта виявлені субодиниці P-модуля були виявлені у мембранній фракції, але не у розчинній фракції.

обговорення

До нашого звіту повідомлялося лише про один варіант NDUFAF4 (c.194T> C; s. (Leu65Pro)) в одній родині з кількома пацієнтами, у яких незабаром після народження розвинулась енцефалопатія та молочнокислий ацидоз. Пацієнти або померли в перший тиждень життя через неконтрольований ацидоз, або розвинули важку міопатію, порушення неврологічного розвитку та періодичний метаболічний ацидоз. МРТ головного мозку одного пацієнта у віці 16 місяців виявила важку генералізовану атрофію та демієлінізацію мозку. Пацієнти, які пережили неонатальний період, залишились у віці 9-18 місяців через нестабільний ацидоз.

Пацієнт, описаний у цьому рукописі, носить новий варіант помилки NDUFAF4 і демонструє синдром Лі і затримку розвитку. Це підкреслює неврологічний фенотип, спричинений дефіцитом NDUFAF4, додаючи до його спектру синдром Лі, певну мітохондріальну хворобу.

Хоча дефіцит комплексу I може супроводжуватися дефіцитом інших комплексів OXPHOS, 9 CIII та CIV, як правило, стабільні у випадку дефіциту комплексу I. Однак їх розподіл у цьому середовищі не вивчався у фібробластів пацієнта. Ми показали, що некомплексні види CIII та CIV, асоційовані з I, не збільшуються однаково, але конкретно змінюються, коли утворення I/III- та I/III/IV комплексів n-хелперів порушено.

Наслідки варіантів NDUFAF4 для складання CI у фібробластах пацієнта не досліджені. 2, 6, 11 Наша нещодавно опублікована детальна модель складання людського CI показала, що процес складання CI відображає його модульну архітектуру: 1 субодиниці різних функціональних модулів збираються окремо, і більшість міжмодульних асоціацій не відбувається до завершення остаточних етапів біогенезу CI NDUFAF4 асоціюється з проміжними проміжними збірками модуля Q. 1 Ця асоціація утворюється під час раннього зібрання КІ та зберігається до останніх етапів біогенезу, де NDUFAF4 дисоціює безпосередньо перед завершенням збору КІ.

Експерименти з фракціонування не виявили субодиниць β-модуля у розчинній фракції, а отже, жодних доказів порушення вставки мембрани у фібробласти пацієнта. Однак попередні дослідження показали, що субодиниця β-модуля ND1 деградує швидше за відсутності NDUFAF4. Таким чином, цей механізм не можна повністю виключити, оскільки можлива порушена інтеграція мембрани з подальшою негайною деградацією субодиниць.

Ми показали накопичення частин усіх модулів, крім модуля Q, з яким з'єднується NDUFAF4. Накопичення N- і P-модуля може стати вторинним ефектом через обмежену збірку Q-модуля. Однак це також може свідчити про те, що NDUFAF4 необхідний для підключення окремо зібраних компонентів P-модуля та N-модуля до Q-модуля. NDUFAF4, швидше за все, необхідний для двох етапів складання: (i) приєднання підмножин P P- b/P D- та Q/PP-a для створення підмножини Q/P 1 та (ii) додавання N-модуля для завершення CI ( Додатковий малюнок 2).

На закінчення, наше дослідження розширює фенотиповий спектр, пов'язаний з дефіцитом NDUFAF4, та проливає світло на роль NDUFAF4 у компіляції CI. Майбутні дослідження будуть зосереджені на молекулярному механізмі дії факторів складання.