ДИСЕРТАЦІЯ УНІВЕРСИТЕТСЬКОГО ДИСТОРАТА György Trencsényi Створення та характеристика нових клітинних ліній експериментальних пухлин, індукованих хімічними канцерогенами. Наукові керівники: проф. Д-р.
Зміст 1. Вступ 7 2. Огляд літератури 10 2.1. Хімічні канцерогени 10 2.1.1. Механізм дії хімічних канцерогенів 11 2.1.2. N-нітрозодиметиламін (DMNA) 13 2.1.3. 7,12 - Диметилбенз (а) антрацен (DMBA) 17 2.2. Трансплантація експериментальних пухлин 19 2.3. Моделі метастазування 20 3. Матеріали та методи 24 3.1. Використані хімічні речовини та розчини 24 3.2 Експериментальні тварини 25 3.3 Експериментальні пухлини 25 3.4. Хірургічна процедура 26 3.5. Встановлення лінії пухлинних клітин 27 3.6. Виділення клітин фібробластів у щурів Фішера 344 28 3.7. Виділення клітин гепатоцитів з печінки щурів Фішера 344 28 3.8. Дослідження регенеруючих клітин печінки 29 3.9. 18 Вимірювання накопичення FDG 29 3.10. Імуноцитохімія 31 3.11. Імуногістохімія 31 3.12. Вестерн-блот-аналіз 32 3.13. Проточні цитометричні вимірювання 32 3.14. Виділення структур хроматину 33 3.15. Обробка даних 34 4. Результати 35 4.1. Гепатоцелюлярна карцинома (He/De) 35 4.1.1. Він/Де-мічені клітини гепатоцелюлярної карциноми починають рости у вигляді твердої пухлини при імплантації під ниркову капсулу щурів F344 35 2
Список скорочень: 18 FDG: 2- [18 F] фтор-2-дезокси-D-глюкоза 18 FDG-6-P: 2- [18 F] фтор-2-дезокси-D-глюкоза-6-фосфат ATCC: Американська колекція культур культури DAPI: 2,6-діаміно-2-феніліндол DMBA: 7,12-диметилбенз (а) антрацен DMNA: N-нітрозодиметиламін, диметилнітрозамін DSMZ: Deutsche Sammlung von Microorganisms und Zellkulturen GmbH (Німецька колекція мікроорганізмів та клітинних культур) ) FBS: фетальна теляча сироватка FITC: флуоресцеїн ізотіоціанат GLUT: транспортер глюкози H&E: фарбування гематоксилін-еозином He/De: гепатоцелюлярна карцинома щура ip: внутрішньочеревно ID%: доза інкубації% радіоактивності до 10 клітин iv: внутрішньовенно My1/De: щур мієло лейкемія Ne/De: мезобластична нефрома щурів ПЕТ: Позитронно-емісійна томографія ROI: Область інтересів sc: субктан (підшкірний) SDS: додецилсульфат натрію SGLT: котранспортер натрію/глюкози. томографія ВООЗ: Всесвітня організація охорони здоров'я 6
вимагає надзвичайно великої кількості добровільних контрольних та лікуваних груп з клінічних фармакологічних досліджень, а результати можуть бути оцінені лише через багато років, навіть десятиліть. Ці методологічні труднощі ускладнюють наукові дослідження в галузі хіміопрофілактики. Експерименти, проведені нами протягом останніх років, послужили спрощенню та надійності доклінічних досліджень. Ми хотіли розробити метод, який забезпечує надійні результати за відносно короткий проміжок часу у відносно невеликої кількості тварин, розглядаючи при цьому всі три типи пухлин та контролюючи метастази, що розвиваються. У цих дослідженнях ми вважали експериментальну систему найбільш підходящою, коли клітини гепатокарцином, мезобластних нефром та мієломонобластних лейкозів, індукованих хімічними канцерогенами 10 6 (
клітинні лінії можуть бути розроблені з культури, яку можна підтримувати замороженою та повторно імплантувати під нирки. 2. Ми хотіли довести, що хімічно індуковані 10 6 пухлинних клітин, трансплантованих під нирку, у всіх випадках утворюють метастази в лімфатичні вузли, і ми мали на меті визначити час, необхідний для розвитку метастазів. 3. Я хотів вивчити розподіл хімічно індукованих пухлинних клітин методами візуалізації. Метою було порівняти три типи хімічно генерованих пухлин та механізм поглинання 18 FDG нормальних клітин та продемонструвати, що методи діагностики пухлини з 18 радіофармацевтичними препаратами FDG, які були перевірені в людській практиці, можуть бути використані при хімічно індукованих пухлинах та їх щурах. 4. Ми хотіли дослідити структуру хроматину, процеси конденсації хроматину та їх відмінності порівняно з нормальними клітинами та регенеруючими клітинами печінки в хімічно індукованих клітинах пухлини гепатокарциноми. 9
Деякі канцерогени діють безпосередньо без хімічного перетворення (наприклад, диметилсульфат), але більшість з них діють після ферментативної активації та біотрансформації (цитохром Р-450-залежні моноаміноксидази). В процесі неефективний прокарциноген спочатку виробляє проміжний канцероген слабкої дії, а потім остаточний канцероген сильної дії. Аналітичні дослідження показали, що зв'язування кінцевих канцерогенів з атомами кисню та азоту 6 гуаніну, атомами азоту 1, 3 і 7 аденіну, атомами азоту 3 цитозину та атомами тиміну 4 тиміну найпоширеніші на його атомі кисню. Фігура 1. Загальна схема механізму дії хімічних канцерогенів (за Хілл, 1987). 12
тим самим утворюючи 7-нітрометилгуанін (N 7 -MeG) або 6-оксиметилгуанін (O 6 -MeG) (рис. 3). O 6 -MeG поводиться так, ніби він був аденином і утворює пару основ з тиміном. Таким чином, під час послідовного поділу клітин, вихідна пара GC стає спочатку 6-оксиметилгуаніновою тиміновою парою, а потім парою аденинової тиміну, таким чином змінюючи код. Малюнок 3. Індуковані DMNA аддукти. Література про хвороби, спричинені людською DMNA, дуже бідна, але відомо, що частота гострого некрозу збільшується у людей, які зазнали дії DMNA, і що вплив протягом двох років викликає цироз (Freund, 1937). Ця сполука може також бути відповідальною за велику кількість пухлин стравоходу та шлунку, що спостерігаються в Африці. 16