Короткий зміст:

Виснаження Т-клітин кісткового мозку шляхом противотокової відцентрової елюції знижує ризик захворювання трансплантат проти господаря (РТПХ). Однак із-за високих показників відмови трансплантата та рецидиву, лише елюація не покращила виживання. Ми провели клінічне дослідження фази II у 54 педіатричних пацієнтів, щоб визначити, чи покращує адгезію відбір CD34 + для порятунку плюрипотентних стовбурових клітин з дрібноклітинної фракції. Оброблені трансплантати містили в середньому 5,5 х 10 7 клітин/кг IBW, 4,7 x 10 6 CD34 + клітин/кг IBW і 6,3 x 10 5 CD 3+ клітин/кг IBW. Пацієнти досягли ANC> 500 при медіані 16 днів та кількості тромбоцитів> 20 000 при медіані 28 днів. Частота клінічно значущих РТПХ становила 19%. Загалом 10 пацієнтів, які брали участь у цьому дослідженні, зазнали відмови від трансплантата, причому вісім із 14 пацієнтів були пересаджені за доброякісними показаннями, які неможливо було стабільно встановити. Невдача трансплантата була статистично значимо пов'язана з недіагностованим діагнозом (Р 3, 4, 5, цей підхід несе потенційний ризик збільшення захворюваності та смертності, пов'язаних з трансплантацією.

Противоточна відцентрова елюція (CCE) відокремлює клітини кісткового мозку на основі седиментаційних властивостей і, як було показано, забезпечує майже повне відновлення клітин у кількох фракціях. 6 Лімфоцити поділяються на дрібні та середні клітинні фракції, тоді як крупноклітинна фракція містить більшу частину КУО-ГМ у колекції кісткового мозку і в 100-1000 разів виснажується лімфоцитами. Ранні дослідження в цьому закладі показали, що коли велика фракція клітин використовується як єдиний компонент трансплантата, частота клінічно значущих РТПХ може бути значно зменшена. Однак частота відмови трансплантата зросла до 10%. У пацієнтів, які отримували менші дози лімфоцитів (5 х 105 проти 1 × 106 лімфоцитів/кг ідеальної маси тіла), спостерігалася уповільнена адгезія гранулоцитів і тромбоцитів та висока частота змішаного гемопоетичного химеризму, визначеного за допомогою аналізу RFLP кісткового мозку. Хоча інші дослідники повідомляли про рівень відмови трансплантата лише на 5% лише за допомогою ХЕВ10, 10 цей показник вищий, ніж при трансплантації кісткового мозку без маніпуляцій. 11, 12

У 1990 р. Джонс та співавт. 13 показали на моделі миші, що для успішного приживлення необхідні два класи клітин: віддані родоначальники, які забезпечують початкові, але не підтримувані трансплантати, та плюрипотентні гематологічні стовбурові клітини (ПМСК), які забезпечують відстрочене та постійне приживлення. Ці PHSC копулюються з лімфоцитами у фракціях дрібноклітинної елюції і, таким чином, секретуються з алотрансплантата TCD. На цій основі було розроблено дослідження I фази з використанням селекції CD34 + для отримання PHSC з фракції елюйованих дрібних лімфоцитів. 14 Врятування малих клітин CD34 + може значно скоротити час до приживлення, в той час як низька частота серйозних GVHD, що спостерігається при стандартній елюації TCD, зберігається.

Потім були проведені клінічні дослідження фази II для подальшого з'ясування ролі виснаження Т-клітин, CD34 + кісткового мозку у відповідних братів і сестер та не пов'язаних трансплантацій. Результати дослідження у дорослих 15, 16 років показали, що як гостра, так і хронічна РТПХ були значно знижені, а вибір CD34 + стовбурових клітин був пов’язаний із швидким прищепленням та скороченням стаціонару. Частота відмови трансплантата у 3,6% була вищою, ніж у неманіпульованих трансплантаціях кісткового мозку, 11, 12, але це можна пояснити відомими факторами ризику у чотирьох із п’яти пацієнтів. Троє пацієнтів з АМЛ перенесли тромбоцити від донора кісткового мозку до трансплантації, і, таким чином, були спеціально алоімунізовані. Четвертий пацієнт мав 3-річну апластичну анемію, яка переросла в мієлодиспластичний синдром (МДС). П'ятий пацієнт зазнав пізньої недостатності трансплантата> 155 днів після ВМТ за відсутності відомої інфекції або РТПХ, і причини цієї недостатності невідомі.

Зараз методика елюації відбору стовбурових клітин CD34 + вивчена у педіатричних пацієнтів, які проходять алогенну ІМТ, і результати цього клінічного дослідження фази II представлені тут. Як і у дорослих, у цих пацієнтів спостерігалося значне зменшення клінічно значущої РТПХ та часу до трансплантації. Однак набагато вища частота відмови трансплантата спостерігалась у цієї популяції, особливо у дітей, які перенесли ІМТ при доброякісних спадкових розладах.

Матеріали і методи

Вибір пацієнта

У період з 1 січня 1995 р. По 31 серпня 2000 р. Педіатричні пацієнти у віці від 6 місяців до 21 року, які відповідали певним критеріям діагностики та прийнятності, були включені в один із трьох інституційних протоколів із використанням того самого лікування трансплантата. Пацієнти, які приймали участь у цих протоколах лікування, відповідали встановленим критеріям захворювання та прийнятності: вік старше 6 місяців; адекватне тестування функції легенів (> 75% від передбачуваного значення); фракція викиду> 50%, продемонстрована на ехокардіограмі або MUGA; адекватна функція печінки, як показано білірубіном 17 метилпреднізолоном у дозі 10 мг/кг за добу до трансплантації −3, −2 та −1 для усунення залишкових лімфоцитів господаря; метилпреднізолон у дозі 0,5 мг/кг/добу в/в від 7 до 14 днів та 1,0 мг/кг/добу в/в від 15 до 28 днів; пероральний преднізон у дозі 0,8 мг/кг/добу з 29 по 42 день, у дозі 0,5 мг/кг від 43 до 56 днів, у дозі 0,2 мг/кг/добу від 57 до 71 дня та при доза 0,2 мг/кг через день через дні. 72-79. Прийом стероїдів припинено через 79 днів, коли аналіз стимуляції АКТГ показав ендогенне вироблення стероїдів.

CCE та CD34 + вибір

Виділення клітин за допомогою CCE було описано вище. 18 Клітини кісткового мозку Баффі мантії готували на системі аферезу COBE Spectra, створеній для обробки кісткового мозку (COBE BCT, Lakewood, CO, USA). Потім клітини, що містять 96% зібраних одноядерних клітин, поміщали в елюційний ротор і камеру Beckman JE-10x (Beckman Instruments, Пало-Альто, Каліфорнія, США) при 20 ° C, швидкості потоку 50 мл/хв і швидкості ротора 3000 об/хв. Було зібрано три фракції: (1) дрібноклітинна фракція, що складається з еритроцитів і дрібних лімфоцитів; (2) фракція середніх клітин, що складається з великих лімфоцитів, гранулоцитів і моноцитів; та (3) фракція великого ротора, що складається з гранулоцитів, моноцитів, бластів і 11. Після елюації фракція насичення та фракції малого та середнього розміру об'єднуються та інкубуються з антитілом миші проти CD34. Потім клітини концентрували, промивали та ресуспендували, а клітини CD34 + збирали за допомогою автоматизованого концентратора стовбурових клітин Ceprate SC (Cellpro, Bothell, WA, США). Чистоту CD34 + клітин перевіряли за допомогою проточної цитометрії з використанням кон'югованого з фікоеритрином моноклонального антитіла до CD34 (HPCA-2) та CD-3 та кон'югованого флуоресцеїном ізотіоціанатом моноклонального антитіла, що розпізнає CD45 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) .,

Оцінка прищеплення донорів

Початкова прихильність визначалася щоденною оцінкою гематологічних показників та дослідженням кісткового мозку, якщо це диктувалося клінічним перебігом. День прищеплення нейтрофілів визначали як перший із трьох днів поспіль з ANC> 500. Трансплантат тромбоцитів визначали як перший день із кількістю тромбоцитів> 20 000 без переливання тромбоцитів за попередні 7 днів. Стійкість трансплантата оцінювали в дні +30, +60, +90, +180 та через 1 і 2 роки після трансплантації. Аналіз химеризації проводили за допомогою XY FISH (донора, що не відповідає статевій ознаці), або за допомогою зондового аналізу RFLP/ДНК (одностатевого донора). Приживлення визначали як відновлення протягом 30 днів із донорським химеризмом> 95%. Усі пацієнти, які не відповідали цьому критерію, були класифіковані як пацієнти з недостатністю трансплантата. Вторинна недостатність трансплантата визначалася як втрата або постійне зменшення химеризму донорів після досягнення первинного трансплантата.

Статистичні методи

Кількість клітин приблизно нормально розподілялося після логарифмічного перетворення. Отже, наводяться середні геометричні номери клітин, а кількість клітин, перетворених в журнал, використовували у всіх статистичних аналізах. Час подій вимірювали з дати БМТ у пацієнтів, яких цензурували на момент смерті, або з дати останнього спостереження. Розподіл часу події оцінювали за допомогою методу обмеження продукту Каплана та Мейєра 19 та довірчих інтервалів, визначених за формулою 20 Грінвуда. Дату та стадію GVHD визначали лікувальна група або команда GVHD та реєстрували відповідно до опублікованих критеріїв. 21 Пацієнтів оцінювали на наявність гострої РТПХ, якщо вони вижили після 30-го дня після ВМТ або розвинули РТПХ до 30-го дня. Пацієнти, які пережили 90 днів після ІМТ, оцінювались на наявність хронічної РТПХ. Точний тест Фішера та оціночні тести Вілкоксона використовувались для визначення гетерогенності. Для порівняння двох засобів використовували t-критерій Стьюдента. Аналіз проводили за допомогою статистичного програмного забезпечення STATA.

результат

Клінічна характеристика

У період з січня 1995 р. По серпень 2000 р. 79 дитячим пацієнтам було проведено первинну алогенну ІМТ у дитячому центрі Джонса Гопкінса. З цих 79 пацієнтів 58 були включені в один із трьох інституційних протоколів із використанням однакових методів відбору стовбурових клітин TCD та CD34 +. Четверо з зарахованих пацієнтів зрештою отримали неекспоновані трансплантати через недостатню кількість клітин (

частота

Зв'язок між часом трансплантації та дозою клітин. a ) кореляція між загальною дозою мононуклеарних клітин та відновленням тромбоцитів; ( b ) кореляція між дозою CD34 + для клітин та відновленням тромбоцитів; ( c ) кореляція між дозою клітин CD3 + та відновленням тромбоцитів; ( d ) кореляція між загальною дозою мононуклеарних клітин та регенерацією нейтрофілів; ( e ) кореляція між дозою CD34 + клітини та регенерацією нейтрофілів; ( f ) Кореляція між дозою клітин CD3 + та регенерацією нейтрофілів.

Повнорозмірне зображення

зловити

Застосування елютрійованих алотрансплантатів, посилених відбором CD34 +, у цій популяції пацієнтів призвело до середнього приживлення нейтрофілів (ANC> 500) через 16 днів (95% ДІ: 15-17 днів) та адгезії тромбоцитів вище 20 000 через 28 днів (95% ДІ: 22, 5–32 дні). Педіатричні пацієнти, які отримували неконтрольовані трансплантати протягом цього періоду часу, мали середній час відновлення нейтрофілів 19 днів (95% ДІ: 17-21,5) та середній час відновлення тромбоцитів 24,5 доби (95% ДІ: 21-28). Час відновлення нейтрофілів був статистично достовірно швидшим у елюйованих реципієнтів трансплантата (Р = 0,009), але не було статистично значущої різниці у швидкості відновлення тромбоцитів (Р = 0,37). Не було зв’язку між часом трансплантації та дозою клітин (рис. 1).

Помилка подачі

З 54 педіатричних пацієнтів, які отримували елютрійовані, розширені алотрансплантати CD34 +, у 10 дітей (18,5%) не було трансплантації. Характеристики трансплантата у хворих з недостатністю трансплантата докладно викладені в таблиці 3. Жодне з дітей, які отримували необроблений кістковий мозок протягом цього періоду, не виявляло недостатності трансплантата. Невдача трансплантата була статистично достовірно пов'язана з недіагностуванням вихідного діагнозу (P 15 повідомляв, що це ускладнення було в основному подолано посиленням алотрансплантата за допомогою стовбурових клітин CD34 +. З 110 дорослих пацієнтів, які отримували лікування у цьому дослідженні з однаковими трансплантаціями братів і сестер та маніпуляціями, подібними до трансплантата лише п’ять пацієнтів (4,5%) мали недостатність трансплантата, а у чотирьох з п’яти пацієнтів недостатність трансплантата пояснювали відомим фактором ризику, включаючи апластичну анемію, великі переливання пластин перед трансплантацією або попередню сенсибілізацію до антигенів гістосумісності донорів. пацієнтів.

З 10 повідомлених у цьому документі 10 пацієнтів із відмовою від трансплантації, вісім перенесли ІМТ через доброякісні захворювання. Сім випадків ранньої недостатності трансплантата неможливо пояснити недостатньою кількістю клітин у трансплантаті. Середня кількість мононуклеарних клітин у цій підгрупі пацієнтів була вищою, ніж у всій групі елюйованих трансплантатів (6,38x107 проти 5,5x107), а найменша доза клітин становила 2,95 × 107 мононуклеарних клітин/кг IBW. Подібним чином середня кількість CD34 + та середня кількість CD3 + клітин були вищими у пацієнтів із відмовою від трансплантата, ніж у всій досліджуваній групі. Жоден з збоїв трансплантата не був пояснений попередньою сенсибілізацією HLA. Хоча обидва пацієнти з таласемією отримували численні переливання еритроцитів до трансплантації, жоден з них не отримував донора кісткового мозку. Крім того, жоден з чотирьох пацієнтів ніколи не отримував переливання тромбоцитів до ІМТ.

Усі 10 пацієнтів, які перенесли недостатність трансплантата, отримували профілактику РТЗ із CSA, а чотири пацієнти з не пов’язаним або некогерентним сімейним донором HLA отримували профілактичні стероїди. Терапевтичний рівень CSA підтримувався у всіх пацієнтів. У одного пацієнта розвинулася клінічно значуща РТПХ. Дисбаланс алореактивності хазяїна проти трансплантата схильний до відторгнення, тоді як РТПХ сприяє трансплантації донора. Цей пацієнт мав лише лімфоїдний химеризм, а рятувальна терапія рефрактерних РТПХ була високолімфотоксичною.

У нашому дослідженні шість з 12 пар донорів - реципієнтів із пацієнтами чоловічої статі та жінками-донорами - зазнали невдалої трансплантації. Асоціація між гендерною невідповідністю та нетрансплантацією наблизилася до статистичної значущості із значенням Р 0,07. Інші автори виявили зв'язок між відмовою трансплантата та гендерною невідповідністю у трансплантатах TCD, 23, 24, але асоціація була більш вираженою у пацієнтів з чоловіками-донорами. Подібним чином, дослідження BMT для важкої апластичної анемії, проведене в цьому закладі, виявило підвищений ризик відторгнення, коли пацієнти отримували кістковий мозок від донорів-чоловіків. 25 Доповідь Європейської групи з трансплантації крові та кісткового мозку на неспоріднених трансплантаціях донорів при анемії Фанконі 26 виявила більшу частоту первинної недостатності трансплантата у жінок-донорів, але ця висновок пояснюється низькою кількістю жіночих клітин кісткового трансплантата. Цього не було у наших пацієнтів та донорів з пересадкою трансплантата.

Вірусна інфекція може бути пов'язана з недостатністю трансплантата, і один пацієнт із СКІД задокументував грип А з посіву мокротиння, отриманого через 1 день після трансплантації. У двох із трьох пацієнтів, яким була проведена передтрансплантація з високими дозами кондиціонування цитоксану, розвинулася вірусна BK-гематурія, але не існує зв'язку між зараженням вірусом BK та відмовою трансплантата. Ранній антиген ЦМВ був виявлений у пацієнта з АЛД за 1 місяць до відторгнення трансплантата та був адекватно пролікований ганцикловіром без розвитку цитопеній або хвороби ЦМВ.

Недостатність трансплантата при таласемії - це добре описаний ризик, частота захворювання коливається від 7% у пацієнтів класу 1 та класу 2 до 22% у пацієнтів класу 3. 27, 28, 29, 30 Хоча кількість пацієнтів з таласемією, які перенесли ІМТ, у нашій серії занадто мала для досягнення статистичної значущості, частота відмови трансплантата у трьох із чотирьох пацієнтів є клінічно важливою і набагато вищою, ніж вважалося в сучасній літературі . Крім того, усі троє пацієнтів з таласемією, які перенесли недостатність трансплантата, були класифіковані до класу 1, і тому очікуваний ризик недостатності трансплантата становив лише 7%. Цікаво, що одного пацієнта з нашої серії, який досяг постійного дотримання, було призначено до 3 класу.

Використовуючи CCE для виснаження трансплантата Т-клітинного кісткового мозку та проточної цитометрії для порятунку стовбурових клітин CD34 + з багатої лімфоцитами фракції, нам вдалося досягти швидкої адгезії донорського кісткового мозку при збереженні низьких показників клінічно важких РТПХ. Цей метод маніпуляції трансплантатом привів до зменшення Т-клітин у 200 разів порівняно з урожаєм перед обробкою та збільшення у 2 рази стовбурових клітин CD34 + порівняно з елюйованими роторними фракціями. Додавання CD34 + стовбурових клітин до алотрансплантату запобігало відстроченому трансплантату, який спостерігався при одиночному елюйованому кістковому мозку. Наші пацієнти показали медіану часу до нейтрофілів (ANC> 500) та тромбоцитів (> 20 000 без переливання протягом 7 днів) через 16 днів та 25 днів. Ці результати подібні до тих, що описані O'Donnell та співавт. 15 у дорослих пацієнтів, яким була проведена відповідна трансплантація братів або сестер із аналогічно приготованими алотрансплантатами.

Частота клінічно значущих РТПХ (19%), що спостерігалися в цьому дослідженні, була низькою. У пацієнтів, які перенесли ІМТ, не пов’язані з HLA, частота клінічно значущих РТПХ перевищувала 75% у необроблених трансплантатів та профілактики CSA/метотрексату. Хоча певний ступінь GVHD бажаний через пов'язаний з цим ефект трансплантата проти лейкемії, точне титрування GVHD важко. Отже, РТПХ залишається основною причиною захворюваності та смертності при неспоріднених трансплантаціях. У цій установі використання простого ТЦД знизило частоту клінічно значущих РТПХ нижче 25%. Однак простий TCD був пов'язаний з більшою частотою (10%) відмови трансплантата, і тому не призвів до загального поліпшення виживання. Одночасне використання збільшення CD34 + з елюацією дозволило нам досягти швидкого та стійкого приєднання, зберігаючи низькі показники тяжких РТПХ. У паралельному дослідженні серед дорослих пацієнтів, яким була проведена відповідна трансплантація братів і сестер, О'Доннелл та співавт. Вони повідомили лише про 11% клінічно значущих РТПХ. Ці результати узгоджуються з показником 19%, який спостерігається у педіатричних пацієнтів, які проходять супутню та неспоріднену трансплантацію. І той, і інший досвід є значним покращенням у порівнянні з неманіпульованим трансплантатом ВМТ.

У цьому дослідженні 54 педіатричних пацієнтів TCD із збільшенням CD34 + призвів до швидкого приєднання та низького рівня клінічно значущої РТПХ у пацієнтів з гематологічними злоякісними новоутвореннями. Однак у пацієнтів з доброякісними захворюваннями, підгрупи пацієнтів, у яких профілактика РТПХ є найбільш бажаною, оскільки вона не має жодних переваг від трансплантата проти лейкемії, цей метод маніпуляції трансплантатом асоціюється зі значним ризиком відмови трансплантата. Можливі пояснення цієї знахідки включають більший інтактний імунітет порівняно з важко попередньо вилікуваними хворими на лейкемію та алоімунізацією при багаторазових переливаннях еритроцитів. У дітей із доброякісними захворюваннями необхідно буде зменшити ризик відторгнення трансплантата шляхом збільшення імунної абляції за допомогою препаративного режиму та/або поліпшення пригнічення імунітету після трансплантації. Метою цих модифікацій є підтримка переваг CDCD + для збільшення TCD, включаючи швидкий час трансплантації та низький рівень захворюваності на РТПХ, одночасно знижуючи ризик відмови трансплантата.