ДОСЛІДЖЕННЯ КОМБІНОВАНОЇ ТОКСИЧНОСТІ АФЛАТОКСИНУ В1 І ОКРАТОКСИНУ А У ВІТРО ТА В МІДАХ ВІВО В СУМІСНОЇ ТОКСИЧНОСТІ АФЛАТОКСИНУ В1 І ОХРАТОКСИНУ А В ІНФОРМАЦІЇ ВІТРО ТА В ІНФОРМАЦІЙНИХ МОДЕЛЯХ Лаура Ана Коркуера Мартінес ДОКТОРАЛ

вивчення

Дослідницька робота під назвою: ВИВЧЕННЯ СУМІСНОЇ ТОКСИЧНОСТІ АФЛАТОКСИНУ В1 І ОКРАТОКСИНУ А В МІСТАХ ВІТРО І ВІВО СУМІСНА ТОКСИЧНІСТЬ АФЛАТОКСИНУ В1 І ОХРАТОКСИНУ А ВІТРО І В ВІВО МОДЕЛІ, представлена ​​пані Лаура Ана Коркупір від Університету Наварри, було проведено в Департаменті харчових наук, фізіології та токсикології під керівництвом доктора Адели Лопес де Серена Салсаменді та спільного керівництва доктора Олени Гонсалес-Пеньяс Памплона, квітень 2012 р. Адела Лопес де Cerain Salsamendi Dra. Олена Гонсалес-Пеньяс

Ця робота фінансується проектами: Мікотоксини: токсичність комбінованого лікування охратоксину А та афлатоксину В1 у моделях in vitro та in vivo Міністерство науки та інновацій уряду Іспанії Довідково: AGL2008-01437/ALI Наявність токсинів у їжа та її участь у здоров’ї людини CAN Foundation Посилання: 10829

Моїй родині з Памплони, Бегоньї, Мігеля, Ландера, Хав'єра, Хосе, Асьє, Тхікітіна, Марії, Маноло. за те, що прийняв мене з такою силою прихильності та змусив почувати себе як вдома. Ібану за те, що я робив кожен крок зі мною на цьому шляху, за те, що я вставав, коли я падаю, і за твоє терпіння. Дякую, що так сильно мене любиш і так добре розумієш. Ця теза також ваша, і майбутнє за нами. Моїй родині за турботу про мене. Ама, бабуся та дідусь, які бачили початок, а з неба бачать кінець. Аль Яйо, який може насолоджуватися цим тріумфом зі мною. Моїм дядькам Ігнасіо та Бегоньї, Марії. Моєму братові Луїсу, дякую за ваше заохочення, вашу цікавість і ваше захоплення, ви змушуєте мене хотіти бути кращим з кожним днем. Нічого не було б можливим без моїх батьків, стовпів мого життя. Дякую, що навчили мене, що добре виконана робота - це сам успіх. Дякую за вашу любов, за те, що ви повірили в мене і дали мені зрозуміти, що можу. Це теж ваш приз. ДЯКУЮ ВСІМ! 9

Мої батьки Ібан Вони отримали його, бо не знали, що це неможливо Жан Кокто

Абревіатури/Скорочення СКОРОЧЕННЯ/СКОРОЧЕННЯ 3-АДОН: 3-ацетилдезоксиніваленол/3-ацетилдезоксиніваленол 8-оксо-дГ: 8-оксогуанін/8-оксогуанін 15-АДОН: 15-ацетилдезоксиніваленол/15-ацетилдеваксинол1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФБ1 АФМ AFB1-формамідопіримідин/AFB1-формамідопірімідин AFB2: Афлатоксин B2/Афлатоксин B2 AFBO: AFB1-екзо-8,9-епоксид/AFB1-екзо-8,9-епоксид AFG1: Афлатоксин G1/Афлатоксин G1 AFG2: AFlatoxin G1: AFlatoxin G1: Aflatoxin G1: AFlatoxin B2 AFG2 G2 AEFI: Іспанська асоціація фармацевтичних препаратів галузі AOAC: Міжнародна асоціація аналітичних хіміків/Асоціація офіційних аналітичних хіміків Сайт AP: Апіримідиновий або апуриновий сайт AU: Довільні одиниці bw: Вага тіла CIT: Цитриніна/Цитринін CV: Коефіцієнт варіації DCFH - DA: Дігідродихлорфлуоресцеїн діацетат/Дігідродихлорфлуоресцеїн діацетат DL 50: Смертельна доза 50 DON: Дезоксиніваленол/Дезоксиніваленол DTI: Щоденно допустимий прийом EC: Європейська комісія/Європейська комісія EFSA: Європейський орган безпеки Аліментарія/Європейське управління з безпеки харчових продуктів 13

Абревіатури/Абревіатури OECD: Організація економічного співробітництва та розвитку/Організація економічного співробітництва та розвитку OTA: Охратоксин A/Охратоксин A PBS: Фосфатний буфер/Солевий розчин, забуференний фосфатом шт: Вага тіла PECE: Збагачений поліфенолом екстракт какао/поліфенол збагачений екстракт какао pk a: Константа дисоціації кислоти RE: Відносна помилка SCF: Науковий комітет з питань харчових продуктів Європейської комісії/Науковий комітет з харчових продуктів SCOOP: Наукове співробітництво з харчових питань/Наукове співробітництво з питань, що стосуються харчових продуктів) РФ: Відносна флуоресценція АФК: Реактивні форми кисню/Реактивні форми кисню RSD: Стандартне відхилення/Відносне стандартне відхилення SE: Стандартна помилка t 1/2: Період напіввиведення/Період напіввиведення елімінації T-2: Токсин T-2/T-2 токсин TWI: Допустиме щотижневе споживання UA: Довільні одиниці UHPLC-LD: Ультрависока рідинна хроматографія розчин з ультрафіолетовим детектором/Ультрависокопродуктивна рідинна хроматографія-флуоресцентний детектор УФ: Ультрафіолетовий детектор ВООЗ: Всесвітня організація охорони здоров’я/Всесвітня організація охорони здоров’я ZEA: Зеараленон/Зеараленон 15

ЗМІСТ/ЗМІСТ Розділ 1/Розділ 1 Загальне/загальне вступ Вступ 17 Розділ 2 Мета, завдання та схеми 55 Розділ 3 Охратоксин А зменшує пошкодження ДНК, викликане афлатоксином В1, виявлене аналізом комет у клітинах Hep G2 61 Розділ 4 Збагачений поліфенолом екстракт какао зменшує кількість вільних радикалів, що виробляються мікотоксинами 85 Розділ 5 Валідація аналітичного методу UHPLC-FLD для одночасної кількісної оцінки афлатоксину В1 та охратоксину А у плазмі, печінці та нирках щурів 109 Розділ 6 Підхід до токсичності та токсикокінетики афлатоксину В1 та охратоксину А після одночасного перорального введення щурам F344 135 Розділ 7 Охратоксин А зменшує генотоксичність афлатоксину В1: Одночасне застосування мікроядерних речовин in vivo та аналіз комет 159 Розділ 8 Загальне обговорення 187 Розділ 9/Розділ 9 Висновки/Висновки 207 17

Глава 1/Глава 1 Загальний вступ/Загальний вступ

Глава 1/Глава 1 AFLATOXIN B1 Хімічні властивості AFB1 належить до сімейства куфуринів дифурану. Його систематична номенклатура - 2,3,6aα, 9aα-тетрагідро-4-метоксициклопента [c] -b-фуро [2 ', 3': 4,5] фуро [2,3-h] хромен-1,11-діон, C 17H 12O 6 - це його молекулярна формула, а його маса - 312,27 г/моль. Незначні зміни в його хімічній структурі породжують набір афлатоксинів, які можна знайти в природі (AFB1, AFB2, AFG1 і AFG2). AFB1 - це найвища концентрація, за якою йдуть AFG1, AFB2 та AFG2. Порядок дотримання цих речовин щодо їх гострої та хронічної токсичності - AFB1> AFG1> AFB2> AFG2 і безпосередньо пов’язаний зі здатністю утворювати епоксид при подвійному зв’язку 8-9 (позначений червоною стрілкою на малюнку) та потенція, пов'язана з циклопентеноновими кільцями (синя стрілка) (McLean and Dutton, 1995). Афлатоксини М1 та М2 є продуктами гідроксилювання окисного метаболізму афлатоксинів В1 та В2 відповідно. Рисунок 1: Присутні в природі афлатоксини (EFSA, 2007) 24

Загальне введення/Загальне введення, що індукує утворення 8-OHdG у печінці щурів та качок. Це пошкодження ДНК може спричинити трансверсію G> T, що призведе до внеску в канцерогенність AFB1 (Bedard and Massey, 2006). Малюнок 4: Еволюція аддукту AFB1-ДНК (Smela et al., 2002) 31

Глава 1/Глава 1 про те, що ОТА у своїй фенольній формі (ОТА -) перетворюється в катіон феноксонію (малюнок 8, J), який, у свою чергу, перетворюється в ОТАК (малюнок 8, К) (Рінгот та ін., 2006; Dai et співавт., 2002). З іншого боку, багаторазове введення ОТА здатне значно знизити рівень внутрішньоклітинних антиоксидантів, таких як глутатіон (GSH), супероксиддисмутаза (SOD), каталаза (CAT) або глутатіонпероксидаза (GSPx) у печінці та нирках (Meki та Hussein, 2001) та посилення перекисного окислення ліпідів (Khan et al., 1989). Дослідження структурної активності постулювали, що атом хлору має важливе значення для генотоксичного ефекту ОТА, оскільки хлоровані сполуки, що викликають пошкодження ДНК, попередньо проходять процес біоактивації до бензохінонів (Ringot et al., 2006). Рисунок 8: Формування АФК за допомогою ОТА (Ringot et al., 2006) Дослідження експресії генів показали, що ОТА здатний зменшувати експресію генів, що беруть участь у внутрішньоклітинному окисному захисті, більш інтенсивно в печінці, ніж у нирках (Cavin et al. Al., 2007; Arbillaga та ін., 2008); і це збільшує експресію синтетази оксиду азоту 40

Загальне введення/Загальне введення індуцибельний (inos), фермент, відповідальний за виробництво оксиду азоту (NO). NO може вступати в реакцію з O 2- і утворювати пероксинітрити, які еволюціонують у реакційноздатні форми азоту (RNS), які реагують з ДНК та білками (Marin Kuan et al., 2011). Наявна інформація свідчить про те, що ОТА навряд чи діятиме за допомогою єдиного механізму дії. ОТА, особливо в нирках, генерує окислювальний стрес безпосередньо (утворення радикалів, що змінюють окислювально-відновлювальні цикли) та опосередковано (зниження антиоксидантного захисту). Обидва механізми можуть взаємодіяти, оскільки зниження захисних сил посилює вплив виробництва вільних радикалів (Marin Kuan et al., 2011). Отже, механізм дії, запропонований як відповідальний за канцерогенність ОТА, буде мережею взаємодії епігенетичних механізмів, включаючи інгібування синтезу білка, окислювальний стрес та активацію певних клітинних сигнальних шляхів (Марін Куан та ін., 2008 ). 41

Розділи 1/Глава 1, менші кількості AFB1 та OTA спостерігались у грудях, печінці та нирках, а також у відкладених яйцях (Zahoor Ul Hassan et al., 2011). Існуючі дані показують, що адекватні дослідження для встановлення антагонізмів, синергії та адитивних ефектів є рідкісними та важкими для інтерпретації. В якості відправної точки можна зробити спробу зрозуміти комбіновану токсичність мікотоксинів на основі їх індивідуального механізму дії в клітині. Таким чином, на мікотоксини зі схожими способами дії можна було очікувати адитивних ефектів, або навіть деякі взаємодії можуть бути антагоністичними (Speijers, 2004). У випадку AFB1 та OTA механізми дії дуже різні, але обидва починаються з біотрансформації в цитохромі P450, тому може відбуватися будь-який тип асоціації. На практиці отриманий кількісний або якісний результат може сильно відрізнятися від очікуваного, і, як було розглянуто, AFB1 та OTA можуть давати будь-який тип взаємодії між ними in vitro та in vivo. Результат, здається, залежить від виду або проведеного дослідження токсичності або навіть від типу використовуваної кінцевої точки. 44

Глава 1/Глава 1 ВООЗ, 2001. Оцінка безпеки деяких мікотоксинів у харчових продуктах. ВООЗ, Харчові добавки, серія 47. Wild, C. and Gong, Y., 2010. Мікотоксини та хвороби людини: в основному ігнорується глобальна проблема охорони здоров’я. Канцерогенез 31, 71-82. Williams, J.H., Phillips, T.D., Jolly, P.E., Stiles, J.K., Jolly, C.M. та Aggarwal, D., 2004. Афлатоксикоз людини в країнах, що розвиваються: огляд токсикології, впливу, потенційних наслідків для здоров’я та втручань. Am J Clin Nutr 80, 1106-1122. Вонг, З.А. та Hsieh, D.P.H., 1980. Порівняльний метаболізм та токсикокінетика афлатоксину В1 у мавп, щурів та мишей. Toxicol Appl Pharmacol 55, 115-125. Сяо, Х., Мадх'ястха, С., Марквардт, Р.Р., Лі, С., Водела, Дж. К., Фроліх, А.А. та Kemppainen, B.W., 1996. Токсичність охратоксину А, його відкрита лактонна форма та кілька її аналогів: взаємозв'язок між структурою діяльності. Toxicol Appl Pharmacol 137, 182-192. Zahoor Ul Hassan, M.Z., Khan, A., Khan, I., Javed, Z. and Hussain, 2011. Ефекти індивідуального та комбінованого введення охратоксину А та афлатоксину В (1) у тканини та яйця курей-заводчиків білого леггорна. J Sci Food Agric doi: 10.1002/jsfa.4740. Зелезіч, Д., Доміжан, А.М. and Peraica, M., 2006. Пошкодження ДНК охратоксином А в нирках щурів, оцінене за допомогою лужної комети. Braz J Med Biol Res 39, 1563 54

Мета, завдання та план Глава 2

Мета, завдання та план Глава 8: Найважливіші висновки попередніх розділів обговорюються в цьому розділі. Розділ 9: Представлені основні висновки дослідницького проекту. 59

Глава 3 Охратоксин А зменшує пошкодження ДНК, викликане афлатоксином B1, виявлене методом комети у клітинах Hep G2 Laura-Ana Corcuera., Leire Arbillaga, Ariane Vettorazzi, Amaia Azqueta, Adela López de Cerain Food and Chemical Toxicology 49 (2011) 2883 2889

Глава 3 Анотація Мікотоксини афлатоксин B1 (AFB1) та охратоксин A (OTA) можуть бути присутніми разом у харчових продуктах. Ці харчові забруднювачі вважаються генотоксинами, діючи за різними механізмами. Метою даної роботи була характеристика поєднаних генотоксичних ефектів in vitro обох мікотоксинів у клітинах Hep G2. З цією метою вперше визначали цитотоксичність при ізольованих та комбінованих лікуваннях, щоб визначити діапазон доз досліджень генотоксичності. Спільне опромінення клітин AFB1 + OTA протягом 24 годин призводило до адитивних ефектів. Генотоксичність визначали в клітинах Hep G2 за допомогою модифікованого кометного аналізу з рестрикційними ферментами (ендо III та FPG). Як при одноразовій, так і при комбінованій обробці було виявлено значне утворення активних форм кисню. AFB1 був генотоксичним через 3 год із зовнішньою метаболічною активацією (суміш S9) та через 24 год без метаболічної активації. Спільне опромінення OTA суттєво зменшило пошкодження ДНК, спричинене AFB1, не тільки в місцях перерв та апуринових ділянок, а й у чутливих до FPG сайтах. Явне протиріччя між адитивними цитотоксичними ефектами та антагонічними генотоксичними ефектами можна пояснити, якщо AFB1 та OTA конкурують за однакові CYP, отримуючи більше АФК, але менше аддуктів AFB1. 64

OTA знижує генотоксичність AFB1 in vitro Таблиця 1: Значення IC 50 у клітинній лінії Hep G2 через 24 години одноразового або комбінованого лікування. IC50 мкм HepG-2 AFB1 100 OTA 360 OTA + 100 мкм AFB1 100 OTA + 150 мкм AFB1 200 Рисунок 1: Криві життєздатності Hep G2 через 24 години інкубації з OTA та AFB1 окремо та в комбінації, отримані за допомогою аналізу MTT. Для того, щоб спостерігати суттєвий ефект мікотоксинів разом, кожну комбінацію порівнювали з одноразовим лікуванням ОТА (р 0,05) або 100 та 150 мкм AFB1 (відсутність ознак). Показано середнє та SD серед трьох експериментів. Генотоксичність Через 3 год без суміші щурів S9 AFB1 не спричиняв розривів ланцюгів ДНК або ділянок АР (фігура 2А), і ніякої значної шкоди не виявлено після ферментної обробки (фігура 2B). На відміну від цього, коли була використана метаболічна активація, суттєвий взаємозв’язок доза-реакція виявився при прямих розривах ланцюгів ДНК, починаючи з 30 мкм (рис. 2С). Більше того, значне збільшення пошкодження ДНК було виявлено FPG при тій же концентрації (малюнок 2D). Через 24 години лікування AFB1 спостерігався ефект реагування на дозу при значних розривах ланцюга, спричинених ДНК (малюнок 2Е). Крім того, при 6 мкм було продемонстровано чітке значне індукування сайтів FPG, яке не з’явилося через 3 год (фігура 2F). No 71

OTA зменшує генотоксичність AFB1 in vitro Рисунок 2: Генотоксичні ефекти AFB1 через 3 год (А і В), 3 год при 2,5% суміші щурів S9 (С і D) та 24 год лікування (Е і F), ​​виміряні за допомогою аналізу комет . Пошкодження ДНК вимірювали в довільних одиницях (0-400). Розриви ланцюгів ДНК та ділянки АР наносяться на А, С та Е. Окислювальні пошкодження, виявлені після перетравлення ферментами, представлені у вигляді нетто-ендо III (оранжевий) та чистих FPG-чутливих ділянок (жовтий) у В, D та F. Для того, щоб спостерігати суттєві ефекти лікування, кожну концентрацію порівнювали з необробленими клітинами (C-) (* p 0,05). Показано середнє та SD серед трьох експериментів. 73

Глава 3 Рисунок 3: Порівняльні графіки пошкодження ДНК після опромінення клітин Hep G2 AFB1 та AFB1 + 50 мкм OTA протягом 24 годин, виміряних аналізом комет. Пошкодження ДНК вимірювали в довільних одиницях (0-400). Пошкодження ДНК вимірювали як розриви ниток ДНК та ділянки AP (A) або окислювальні пошкодження, виражені як чутливі ділянки чистих ендо III (B) або FPG (C). Для того, щоб спостерігати суттєві відмінності між лікуваннями, комбінації AFB1 + OTA порівнювали з одноразовим впливом AFB1 (* р 0,05). Показано середнє значення та SD серед трьох експериментів. Малюнок 4: Внутрішньоклітинна АФК клітин Hep G2, оброблених AFB1 (A синім кольором), OTA (B) та сумішами AFB1 + 50 мкм OTA (A світло-блакитного кольору) протягом 24 годин. Рівні АФК виражали як флуоресценцію на відсоток виживання. Результати порівнювали з їх негативним контролем (* р 0,05). Показано середнє та SD серед чотирьох експериментів. 74

OTA знижує генотоксичність AFB1 in vitro 1082-1090. Туреський, R.J., 2005. Перспектива: охратоксин А не є генотоксичним канцерогеном. Chem Res Toxicol 18, Uhl, М., Helma, C. та Knasmuller, S., 1999. Одноклітинні аналізи гель-електрофорезу з клітинами гепатоми людини (Hep G2). Mutat Res 441, 215-224. Urrego Novoa, J.R. та Діаз, Дж. Дж., 2006. Афлатоксини та його механізми токсичності при раку печінки. Rev Fac Med Una 54, 108-116. Wang, H. та Joseph, J.A., 1999. Кількісне визначення клітинного окисного стресу за допомогою аналізу дихлорфлуоресцеїну за допомогою зчитувача мікропланшетів. Безкоштовно Radic Biol Med 27, 612-616. 83

Глава 4 Збагачений поліфенолом екстракт какао зменшує вільні радикали, що виробляються мікотоксинами Laura-Ana Corcuera, Susana Amézqueta, Leire Arbillaga, Ariane Vettorazzi, Sonia Touriño, Jusep Lluis Torres, Adela López de Cerain Food and Chemical Toxicology 50 (2012) 989-995 (2012) 989-995

PECE знижує вміст вільних радикалів in vitro, що підтримується до -20ºC до використання. Розчини PECE та AFB1 зберігали в темряві, щоб уникнути деградації світла. Експерименти проводили без фетальної телячої сироватки (FCS), щоб уникнути взаємодії сироватки з PECE або мікотоксинами, що зв’язуються з білками. Статистичний аналіз Було проведено три незалежних експерименти для перевірки цитотоксичності та індукції АФК. Дані представлені за допомогою описового аналізу [середнє ± стандартне відхилення (SD) повторних експериментів]. Порівняння проводили за допомогою непараметричного H-критерію Крускала-Уолліса та U-критерію Манна-Уітні. Р 0,05 прийнято як рівень значимості. Результати Приготування PECE та середній склад поліфенолу. Екстракт какао вода: ацетон 3: 7, що містить мономери C та EC та олігомери, готували, як описано раніше. Були підготовлені калібрувальні криві C, EC, Cya-Cat та Cya-EC, що охоплювали робочий діапазон. Було проаналізовано шість стандартів кожної сполуки та отримано лінійну відповідь проти концентрації. Аналіз зразків проводили у трьох примірниках, що мають РСД