цикл

  • Предмети
  • Резюме
  • Вступ
  • Результати
  • Вплив кверцетину на життєвий цикл ВГС у клітинах Huh-7,5
  • Вплив кверцетину на життєвий цикл ВГС у первинних гепатоцитах людини
  • При безпосередньому застосуванні до частинок ВГС кверцетин зменшує їх інфекційність.
  • DGAT1, можливий кандидат на кверцетин у встановленні інфекції ВГС
  • Вплив кверцетину на розмір ЛД та субклітинну локалізацію білка серцевини ВГС
  • Обговорення
  • Матеріали і методи
  • Реагенти, антитіла, плазміди та праймери.
  • Культура клітин
  • Аналіз цитотоксичності кверцетину
  • Виробництво ВГС, оцінка та аналіз інфекції.
  • Вірусологічний аналіз
  • Рівні РНК ВГС: аналізи реплікації
  • Виділення РНК, зворотна транскрипція та кількісна кількісна полімеразна реакція (RT-PCR)
  • Виробництво псевдочастинок ВГС
  • Тест активності DGAT
  • Імунофлюоресценція та фарбування маслом червоного кольору O
  • Оцінка спільного розташування
  • Статистичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • Додаткова інформація
  • Документи Word
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

Предмети

Резюме

Кверцетин - природний флавоноїд, який, як було показано, має властивості проти вірусу гепатиту С (HCV). Однак точні механізми впливу кверцетину на життєвий цикл ВГС не до кінця зрозумілі. Ми оцінили ефект кверцетину на різних стадіях життєвого циклу ВГС у ВІЛ-інфікованих клітинах Huh-7,5 та первинних гепатоцитах людини (ПГГ). В обох типах клітин кверцетин суттєво зменшився i) реплікація вірусного геному; ii) продукування інфекційних частинок ВГС та iii) питома інфекційність новоутворених вірусних частинок (85% та 92%, Huh7,5 та PHH відповідно). Крім того, застосовуючи безпосередньо до частинок ВГС, кверцетин знижує свою заражність на 65%, припускаючи, що він впливає на цілісність віріону. Цікаво, що кверцетин запобігав індукованій HCV підвищення регуляції діацилгліцерину ацилтрансферази (DGAT) та типовій локалізації білка серцевини HCV на поверхні крапель ліпідів, що, як відомо, опосередковується DGAT. На закінчення видно, що кверцетин має прямий та опосередкований господарями противірусний ефект проти ВГС.

Вступ

Вірус гепатиту С (HCV) - це оболонка з РНК із позитивною ланцюгом, що належить до сімейства Flaviviridae 1 із 7 основними генотипами 2. Спектр захворювання варіюється від гострого до хронічного гепатиту, цирозу та гепатоцелюлярної карциноми.

Життєвий цикл ВГС тісно пов’язаний з ліпідним обміном клітини-господаря. Механізми, що пов'язують ВГС-інфекцію та ліпідний обмін, включають 3, 4: (а) ВГС циркулює як збагачені ліпідами частинки, які називаються ліповірочастинками (LVP) 5; (b) LVP - це частинки ВГС з найвищою заразністю через їх асоціацію з ліпопротеїнами 6; (c) кілька рецепторів, що беруть участь у поглинанні ліпідів, наприклад, рецептор ліпопротеїнів низької щільності (ЛПНЩ), Niemann-Pick C1-подібний 1 (NPC1L1) 7 та SR-B1, беруть участь у проникненні LVP у гепатоцит 8; (d) складання ВГС відбувається в безпосередній близькості від крапель ліпідів (ЛД) 9, 10; (e) ВГС-інфекція сприяє накопиченню та перерозподілу LD у перинуклеарній області 11; (f) діацилгліцерину ацилтрансфераза-1 (DGAT1), фермент, який синтезує тригліцериди (TG) в ендоплазматичному ретикулумі, взаємодіє з основним білком ВГС і бере участь не тільки у формуванні нових ЛД, але й у виробництві інфекційного ВГС 12; (g) Як повідомляється, ВГС секвеструє шлях секреції ліпопротеїдів дуже низької щільності (ЛПНЩ) для секреції вірусних частинок 13 .

Лікування противірусними препаратами прямої дії (DAA) різко змінило результати гепатиту С. Фактично показники стійкої вірусної відповіді (SVR) досягли рекордних рівнів (> 95%) 14, 15 без відповідних побічних ефектів. Однак ціна залишається однією з головних перешкод на шляху досягнення викорінення гепатиту С, головним чином у країнах з низьким та середнім рівнем доходу 16 .

Результати

Вплив кверцетину на життєвий цикл ВГС у клітинах Huh-7,5

Для оцінки ефекту кверцетину на реплікацію геному HCV клітини Huh-7,5 заражали HCV, продукованим культурою клітин (HCVcc) штаму JFH1, і обробляли 50 мкМ кверцетину, тобто концентрації при тій, що токсичного ефекту не спостерігалось (рис. S1A, a та b). Кверцетин суттєво зменшив внутрішньоклітинну кількість РНК HCV із негативною ланцюгом, що є ознакою реплікації геному HCV, оцінювали на 1 день після інокуляції (61% ± 5,89% інгібування; p = 0,0084) та на 3 день після інокуляції (68,38% ± 10% гальмування; с

Клітини Huh-7.5.1 інфікували JFH1 протягом 6 год, а потім обробляли 50 мкМ кверцетину (JFH1 + Q50 мкМ) або ДМСО в якості контролю носія протягом 24 год ( до ) або 72 год ( б, д ). ( а, б ) Клітини лізували для кількісного визначення негативної ланцюга РНК HCV. ( c, d ) Культуральні супернатанти збирали для визначення позаклітинного рівня РНК HCV та титру інфекційності. Результати виражаються у відсотках від контролю автомобіля. Дані представлені як середнє значення ± SD, отримане в результаті трьох незалежних експериментів.

Повнорозмірне зображення

Вплив кверцетину на життєвий цикл ВГС у первинних гепатоцитах людини

PHH інфікували JFH1 (MOI 2,5) протягом 6 год, а потім обробляли 50 мкМ кверцетину (JFH1 + Q50 мкМ) або DMSO в якості контролю носія протягом 24 год ( до ) або 72 год ( б, с ). ( до ) Клітини лізували для кількісного визначення негативної ланцюга РНК HCV. ( б, с ) Супернатанти культури збирали для визначення позаклітинного рівня РНК HCV та титру інфекційності відповідно. Результати виражаються у відсотках контролю носія. Дані представлені у вигляді середніх значень ± SD, отриманих від двох до трьох незалежних експериментів.

Повнорозмірне зображення

При безпосередньому застосуванні до частинок ВГС кверцетин зменшує їх інфекційність.

( до ) Віріони JFH1-HCVcc інкубували у присутності 50 мкМ кверцетину (JFH1 + Q50 мкМ) або ДМСО в якості контролю носія протягом 1 години при 37 ° С в безклітинних умовах, а потім використовували для інокуляції клітин Huh-7,5. Зараженість ВГС вимірювали через 72 години за допомогою аналізу TCID 50. ( b ) Вплив кверцетину на стадію вступу ВГС. Клітини Huh-7,5 обробляли 50 мкМ кверцетином або ДМСО як контролем носія та трансдукували HCVpp або VSV-Gpp як контроль через 6 год. Через сімдесят дві години після трансдукції було проведено аналіз люциферази. Результати представлені у вигляді середнього значення ± SEM щодо контролю, отриманого в результаті трьох незалежних експериментів.

Повнорозмірне зображення

DGAT1, можливий кандидат на кверцетин у встановленні інфекції ВГС

Ми досліджували вплив кверцетину на експресію ключових генів, що беруть участь у метаболізмі ліпідів (рис. S2, рис. 4а). Результати показали, що гени, що беруть участь у неосинтезі або поглинанні ліпідів [ліпопротеїновий рецептор низької щільності (LDLr), синтаза жирних кислот (FASN), карбоксилаза ацетил-КоА (ACC) та фактор транскрипції, що зв’язуються з регуляторними елементами стеринів 1 (SREBP1c)] регулювались в регульованих клітинах Huh7,5. Експресія мРНК DGAT1 також суттєво зросла при зараженні ВГС (1,79 рази ± 0,35; с

Клітини Huh-7,5 інфікували JFH1 (1 MOI) протягом 72 год у присутності 50 мкМ кверцетину чи ні. ( до ) Рівні експресії мРНК DGAT визначали за допомогою RT-PCR. Результати нормалізували за допомогою GAPDH, а в якості еталону використовували неінфіковані клітини, оброблені DMSO. * p 12 і наші попередні дані 30, ми вирішили додатково дослідити вплив кверцетину на роль DGAT в контексті ВГС-інфекції.

DGAT є ключовими мікросомальними ферментами в біосинтезі TG, а DGAT1 є ключовим фактором господаря для зараження HCV. Насправді DGAT1 взаємодіє з основним білком HCV, який утворює вірусний нуклеокапсид, і необхідний для передачі основного білка до LDs, що є важливим для виробництва інфекційних віріонів 12. Раніше повідомлялося, що кверцетин зменшує синтез TAG, частково через вплив на активність DGAT 26, 27, 31, 32 .

Потім ці результати були підтверджені на рівні активності DGAT, з 2,29 ± 0,23-кратним збільшенням заражених ВГС клітин Huh-7,5 порівняно з неінфікованими контрольними клітинами (p = 0,015) (рис. 4b). Цікаво, що підвищену активність DGAT, індуковану ВГС, можна повністю запобігти обробкою клітин, інфікованих кверцетином (рис. 4), припускаючи, що DGAT є однією з цілей кверцетину в клітинах Huh-7,5, інфікованих HCV.

Вплив кверцетину на розмір ЛД та субклітинну локалізацію білка серцевини ВГС

Крім того, це зменшило рівень зараження при безпосередньому застосуванні до віріонів. Крім того, здатність до зараженості нещодавно продукованих вірусних частинок була зменшена обробкою кверцетином.

Повнорозмірне зображення

На закінчення ми демонструємо, що кверцетин націлений на вірусні фактори та фактори-хазяї, а отже, впливає на інфекційний цикл ВГС на різних стадіях. Наші результати також підтверджують, що HCV секвеструє метаболізм ліпідів господаря, щоб виконати свій життєвий цикл від складання до етапів реплікації. Кверцетин запобігає субклітинній локалізації основного білка в ЛД, що вказує на важливий вплив кверцетину на ліпідний обмін. Крім того, кверцетин може зменшити зараженість ВГС принаймні двома різними механізмами: (i) при застосуванні до клітин-продуцентів він впливає на морфогенез інфекційних частинок, і (ii) при застосуванні до віріонів впливає на їх цілісність.

Матеріали і методи

Реагенти, антитіла, плазміди та праймери.

Всі реагенти, плазміди та праймери, використані в цьому дослідженні, описані в супровідній інформації (таблиця S1).

Культура клітин

Клітини 293T людської ембріональної нирки (HEK) та гепатоми людини (Huh-7 та Huh-7,5) культивували в модифікованому Дульбекко середовищі Eagle із низьким вмістом глюкози (DMEM), доповненому 10% фетальної бичачої сироватки (FBS), 100 ОД/мл пеніциліну, 100 Од/мл стрептоміцину та 2 мМ L-глутаміну у зволоженій атмосфері при 37 ° C та 5% CO 2. (все від Invitrogen Life Technologies). Експерименти з PHH проводились відповідно до французьких законів та керівних принципів. PHH, придбаний у Biopredic International (Ренн, Франція), був виділений із очевидно нормальної тканини печінки, отриманої від дорослих пацієнтів, які перенесли часткову гепатектомію для лікування метастазів, та серонегативного щодо ВГС, вірусу гепатиту В та вірусу імунодефіциту людини за письмової згоди. всі пацієнти. та домовленість Міністра вищого відомства і де-ла-Recherche (ID: AC-2013-1754). Експериментальні протоколи були схвалені французьким національним комітетом з етики (схвалення № D34-172-16). Свіжоізольовані РНГ висівали при щільності 1,6 х 105 життєздатних клітин/см2 на пластини, покриті колагеном, і витримували їх у первинній культурі, як описано раніше 29 .

Аналіз цитотоксичності кверцетину

Для перевірки цитотоксичної дії кверцетину клітини Huh-7,5 та PHH висівали в 6-лункові планшети та обробляли 50 мкМ кверцетину протягом 72 годин. В якості контролю використовували диметилсульфоксид (ДМСО). Життєздатність клітин Huh-7,5 оцінювали за допомогою тесту на виключення трипанового синього. Для оцінки цитотоксичності кверцетину в ПНГ вимірювали активність лактатдегідрогенази, що виділяється в супернатантах культури, за допомогою аналізу нерадіоактивної цитотоксичності CytoTox 96R (Promega), і коефіцієнт витоку лактатдегідрогенази розраховували по відношенню до контролю носія, як попередньо розрахований. описано 39 .

Виробництво ВГС, оцінка та аналіз інфекції.

Для отримання частинок HCVcc клітини Huh-7,5 (4 × 10 6) електропорировали 5 мкг in vitro транскрибованої повної довжини РНК JFH1 40 (генотип-2а) з використанням набору нуклеофекторів лінії клітин Amaxa T (260 В, 950 мкФ Лонза) ) Супернатант культури збирали через 72 год, фільтрували через мембрани полівінілідендифториду розміром пор 0,45 мкм і титрували шляхом зараження наївних клітин Huh-7,5 шляхом серійних розведень. Клітини фіксували через 72 год метанолом при -20 ° C та імуно забарвлювали, використовуючи серцевинне анти-HCV антитіло (C7-50). 50% інфекційної дози культури культури (TCID 50) розраховували, як повідомлялося 41. Вірусні запаси високого титру використовували для інокуляції клітин Huh-7,5 або PHH при MOI 1 та 2,5 відповідно.

Вірусологічний аналіз

Рівні РНК ВГС: аналізи реплікації

Виділення РНК, зворотна транскрипція та кількісна кількісна полімеразна реакція (RT-PCR)

Загальну РНК екстрагували за допомогою Trizol 44. Зразки РНК обробляли DNaseI. Загальна РНК була транскрибована за допомогою комерційно доступних наборів (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen, Hilden, Німеччина) відповідно до інструкцій виробника. Конкретні використовувані праймери наведені в Додатковій таблиці, і гліцеральдегід 3-фосфатдегідрогеназа (GAPDH) була використана як еталон для нормалізації. Рівні експресії генів визначали методом Delta Ct. Зміна згину була розрахована як співвідношення зразок/контроль у трьох незалежних експериментах.

Виробництво псевдочастинок ВГС

Плазміду phCMV 1b9.9, що містить люциферазу як репортерний ген, використовували для отримання псевдочастинок HCV (HCVpp) згідно з описаним способом 45. Вступ VSV-Gpp оцінювався як контроль. Контрольні псевдочастинки генерували за допомогою глікопротеїну VSV-G 46. Сорок вісім годин аналізу люциферази після трансдукції проводили за допомогою набору систем аналізу подвійної люциферази (Promega) відповідно до протоколу виробника.

Тест активності DGAT

Імунофлюоресценція та фарбування маслом червоного кольору O

Клітини Huh-7,5 висівали в 24-лункові планшети із покривними стеклами протягом 24 год і потім інфікували JFH1. Через 6 год клітини обробляли 50 мкМ кверцетином протягом 72 год. Клітини двічі промивали PBS і фіксували параформальдегідом (4%) протягом 10 хвилин і проникали 0,2% Triton X-100 протягом 2 хвилин. Клітини інкубували з антиядерним антитілом (1: 300) та кон'югованим Alexa 488 вторинним антитілом (1: 500). Ядра фарбували 40,6-діамідино-2-феніліндол (DAPI) (1: 1000) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, а нейтральні ліпіди фарбували масляно-червоним O (ORO), як описано раніше 48. Зображення отримували за допомогою конфокального мікроскопа (LSM700Meta, Zeiss) з використанням об'єктива 63x, а площу поверхні LD розраховували за допомогою програмного забезпечення Metamorph (Molecular Devices Corporation, Саннівейл, Каліфорнія).

Оцінка спільного розташування

Підклітинне розташування ядра навколо ЛД аналізували за допомогою програмного забезпечення Imaris. Результати були виражені відповідно до коефіцієнта Мандерса, що описується як статистичне значення, яке базується на коефіцієнті Пірсона із середньою інтенсивністю, взятою з математичного виразу. Цей коефіцієнт коливається від 0 до 1, 0 відповідає зображенням, що не перекриваються, і 1 відповідає 100% колокації.

Статистичний аналіз

Безперервні змінні описуються як значення ± SD або SEM мінімум трьох незалежних експериментів. Тест Стьюдента використовували для порівняння між групами. Значення P P