ISSN 1025 - 5583
Том 57, № 2 - 1996

вплив


Вплив нікотинаміду на втрату рідини при холері

Фабібн Мендоса 1, Ренцо Леун 1

Холера в нашій країні породжує важливі проблеми охорони здоров'я. В даний час його лікують шляхом відновлення втраченого об’єму та усунення V.holerae, але не блокуючи дію токсину. Є дані, що нікотинамід діяв би на токсин, зменшуючи секрецію води та електролітів.

Здатність нікотинаміду зменшувати втрату рідини оцінювали у кроликів з холерою; за допомогою рандомізованого експериментального дослідження.

Нікотинамід вводили 10 здоровим кроликам з кількісною оцінкою їх екскрету (г/день) до та після введення, щоб виключити ефекти, що змінюють інтерпретацію результатів; статистично значущих відмінностей не виявлено (p = 0,3). Через 5 днів, щоб забезпечити елімінацію препарату, кроликів заразили, розділивши їх на 2 групи по 5; Коли виникала діарея, ми вводили нікотинамід і плацебо відповідно, ми кількісно визначали кал (г/день), виявляючи статистично значущу різницю (р

Ключові слова: Нікотинамід, холерний токсин, гуаніновий регуляторний білок, циклічний AMP.

ВПЛИВ НІКОТІНАМІДУ НА ВТРАТИ ХОЛЕРНОЇ РІДИНИ

Холера викликала серйозні проблеми охорони здоров'я в нашій країні. В даний час терапевтичний підхід складається з обох, відновлення втраченого об’єму та усунення мікроорганізму; однак немає жодного терапевтичного втручання, яке блокує дію токсину. Є дані, що вказують на те, що нікотинамід може впливати на токсин, зменшуючи втрати води та електролітів.

У цій роботі аналізували здатність нікотинаміду зменшувати втрати рідини у заражених холерою кроликів шляхом рандомізованого експериментального дослідження. Десять раніше здорових кроликів отримували нікотинамід; масу стільця (г/день) до та після введення нікотинаміду оцінювали для виключення будь-яких побічних ефектів, які можуть змінити результати. До і після введення нікотинаміду (р = 0,3) не спостерігалось суттєвих відмінностей у масі стільця (г/добу). Кроликів заразили V. cholerae через 5 днів (для забезпечення елімінації нікотинаміду); потім були розділені на дві групи (А і В), і по п'ять випадково присвоєно кожній групі. Коли з’явилася діарея, кролики групи А отримували нікотинамід, а кролики групи В - плацебо. Масу стільця визначали кількісно в обох групах, показуючи значну різницю (с

Наше дослідження демонструє, що нікотинамід зменшує втрати рідини, викликані холерою, і відкриває новий шлях терапії.

Ключові слова: Нікотинамід, холерний токсин, G-білки, циклічний АМФ.

ВСТУП

Холера - це гостра хвороба травної системи, яка переслідує людство з незапам'ятних часів (1,2) і має актуальність завдяки своїй універсальності та високій смертності. Таким чином, він прибув до нашої країни двічі, останній - у 1991 році (1,4).

Ця хвороба проявляється внаслідок рясної водянистої діареї, яка за короткий час призводить до дегідратації та гіповолемії, на яких обертається клінічна картина, яка, якщо не вчасно вжити заходів, може призвести до шоку та смерті (2,5).

Стратегії лікування в нинішньому столітті були орієнтовані на відновлення втраченого об’єму та його підтримку; (3,5,6), однак, до цих пір не існує ефективного способу значно скоротити час хвороби, застосовного до всіх пацієнтів, незважаючи на використання антибіотиків, таких як тетрациклін, (7) які знищують Холерний вібріон але не до його токсину, який відповідає за втрату рідини (8).

Як тільки холерний токсин (ТК) проникає в ентероцит, він діє на альфа-субодиницю гетеротримерного білка G (відповідальний за трансляцію позаклітинних сигналів у внутрішньоклітинні відповіді), каталізуючи зв'язування цитоплазматичної АДФ-рибози із зазначеною субодиницею, реакцією, яка називається Рибозилювання АДФ. Це зв'язування виробляє постійну активацію аденилциклази, що, в свою чергу, підвищує рівень цАМФ, збільшуючи секрецію води та електролітів (див. Схему №1). Отже, для T.C. активує білок G, необхідне включення молекули ADP-рибози до альфа-субодиниці (8,9,10).

Ще деякий час тому не було можливості заблокувати цей процес, не маючи можливості діяти терапевтично на такому рівні. Однак було показано, що нікотинамід (NCT) та його похідні знижують внутрішньоклітинний рівень цАМФ, що, як ми пояснили, є суттєвим для виробництва діареї (8,11).

Таким чином, ми вважаємо, що не можна нехтувати цією терапевтичною можливістю, яка, на відміну від тих, що використовувались на сьогоднішній день, нейтралізує спосіб дії токсину.

Таким чином, ми провели це експериментальне подвійне сліпе дослідження, в якому ми продемонстрували антитоксинний ефект НКТ, зменшуючи втрати рідини у кроликів, інфікованих V. холера.

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ

Це дослідження було проведено в Інституті тропічної медицини Національного університету Сан-Маркос, який має лабораторії, обладнані для дослідницьких цілей, а також розплідник для догляду за експериментальними тваринами, у період з 21 серпня по 23 вересня 1995 р. Ми використали 10 кролів породи "Нова Зеландія", які відповідали наступним критеріям відбору:

а) Чоловіки, без явних захворювань, активні та у видимому хорошому загальному стані.

б) Вага: від 1000 до 1200 г.

в) Вік: від 1,5 до 2,0 місяців.

Таким чином, ми стандартизуємо стать, вік і вагу, оскільки поверхня кишечника, на яку діятимуть як КТ, так і НКТ, залежить від згаданих факторів.

  • Ці тварини отримували схожі раціони твердої їжі: Конехіна (Industrias Purina S.A., Ліма - Перу) та люцерна (Medicago sativa) та рідини ad libitum під час виконання.
  • Використовували НКТ із чистотою 99,9% (Laboratorios ROCHE), який розділяли на дози по 100 мг.
  • Штам V. холера використовується було занесено в каталог Холерний вібріон O: 1 біотип El-Tor, множинні серотипи (Огава та Інаба); був виділений та культивований стандартними бактеріологічними методами та забезпечений Департаментом мікробіології Національного університету Мері де Сан-Маркос.

Оскільки ми продемонструємо антитоксинну дію V. холера, Ми виконуємо цю роботу в 2 етапи. Перший спрямований на перевірку того, що НКТ не виробляє змін у вазі екскрементів здорових тварин, а другий - на порівняльний показник зменшення втрат рідини у заражених тварин (оброблених НКТ проти нелікованого контролю).

Перед початком цих стадій ми вирішили «ліквідувати» кишкову флору тварин за допомогою введення Еноксацину (хінолону другого покоління, який охоплює широкий спектр грам (+) та грам (-) при відносно низькому рівні MIC), при 2 доза 20 мг кожна з інтервалом 12 годин. Це було зроблено для скорочення часу інкубації V. холера, що при наявності захисної флори у кроликів становить приблизно 1 тиждень (згідно з нашим пілотним дослідженням), що ускладнює ретельний контроль за ними. Ми зачекали 5 днів, щоб забезпечити його ліквідацію.

1-й етап: Вплив НЗТ на вагу екскрементів у здорових тварин

Щоб виключити інші ефекти NCT, які заважають збору даних та інтерпретації результатів, 100 мг NCT вводили перорально кожному з 10 кроликів, визначаючи вагу стільця на день до та після введення.

Він чекав 5 днів, щоб забезпечити елімінацію препарату, перш ніж переходити до наступного етапу.

2-й етап: Вплив НЗТ на вагу екскрементів у заражених тварин

До цього процесу 10 кроликів, поміщених в окремі метаболічні клітини, були розділені на 2 групи по 5 кроликів (А і В), використовуючи таблицю випадкових чисел.

10 кроликів інокулювали вищезазначеним штамом, вирощували на поживному бульйоні та інкубували протягом 8 годин при температурі 37 ° C, поки не було досягнуто помутніння, подібне до №3 за шкалою Мака Фарлі, за допомогою візуального порівняльного методу. Введена кількість становила 1 мл. кроликом В.О.

Коли ми спостерігали початок діареї (приблизно через 16 годин після щеплення), експериментальній групі (А) вводили дозу НКТ перорально, розчинену в 1 мл дистильованої води. Контрольній групі (В) вводили лише 1 мл дистильованої води.

Кількісне визначення екскрементів проводитиметься з моменту введення НКТ та води, відповідно, протягом двадцяти чотирьох годин, позначених як групи А і В, дослідник, який визначив кількість екскрементів, невідомий, що відповідало група, яка отримувала НКТ, а яка - до групи плацебо.

Перевірка на наявність інфекції V. холера, його проводили на ректальному мазку стандартними бактеріологічними методами.

Для аналізу статистичної значущості асоціації та аналізу засобів використовували параметричний тест дисперсійного аналізу (ANOVA 1 WAY), для якого відповідали критеріям випадковості, нормальності та однорідності дисперсій. Рівень значущості (альфа) вважався статистично значущим

База даних була розроблена в рамках статистичної програми MSTAT-C. Дані оброблялись на 486 мікрокомп’ютері DX2, сумісному з IBM. Результати ваги стільця (безперервні змінні) подаються як середнє значення ± стандартне відхилення, у грамах.

1-й етап: Вплив НЗТ на вагу екскрементів у неінфікованих тварин

  • Значення, отримані у вазі екскрементів 10 здорових кроликів, перед введенням НКТ становили 35,66 ± 4,09.
  • Отримані значення ваги екскрементів 10 здорових кроликів після введення НКТ становили 35,15 ± 3,92.
  • Обидва значення однакові (до і після введення), статистично значущої різниці не виявлено (p = 0,3).

2-й етап: Вплив НЗТ на вагу екскрементів у заражених тварин

Виходячи з того, що групи A та B не мали статистично значущих відмінностей щодо ваги екскрементів у базових умовах (група A = 35,66 ± 4,09, група B = 35,15 ± 3,92) (p = 0,3). Ми приступили до кількісної оцінки екскрементів в обох групах після виявлення діареї, виявивши статистично значущі відмінності між групою, яка отримувала НКТ, та контролем (61,02 ± 6,84 проти 87,2 ± 3,51 відповідно) (p

Додатковим спостереженням є те, що тривалості діареї не зменшувались в обох групах.

Отримані результати показують, що введення НКТ зменшує втрати рідини у тварин, інфікованих холерою.

На першій стадії показано, що НКТ не змінює обсяги стільця у здорових тварин, оскільки статистично значущої різниці (р = 0,3) між випорожненнями не виявлено в дні до та після введення НКТ.

* Суттєвої різниці між обома групами немає (p = 0,3)

На другому етапі антитоксинну дію НКТ перевіряють у заражених кроликів, виявляючи статистично високо значущу різницю (p

Таблиця N ° 2.- Вплив нікотинаміду проти плацебо на втрату рідини у заражених холерою тварин
Група
Кролики 		Вага стільця (гр/день) Середнє значення ± SD
1 два 3 4 5
(A) NCT 91,5 82,6 89.4 85,0 87,5 87,20 ± 3,51
(Б) плацебо 52,6 62,7 62.3 70,7 56,8 61,02 ± 6,84

* Високо значущий (с

Як ми пояснили, НКТ може впливати на молекулярний механізм дії КТ на недостатньо чітко визначеному рівні (2), але очевидно, що він знижує високий рівень цАМФ у уражених ентероцитах (11).

Наші результати можна пояснити біохімічною дією НКТ наступним чином:

а) NCT конкурентно інгібує ADP-рибозилювання Gs альфа.

b) NCT зв'язується з субодиницею А1 ТС, інактивуючи його дію (див. схему № 2).

Ці гіпотези повинні бути підтверджені майбутніми дослідженнями на молекулярному рівні, оскільки вони протиставляються думці деяких авторів, які вважають, що НКТ може змінити процес АДФ-рибозилювання, що нам здається малоймовірним, оскільки розуміє утворення ковалентного зв'язку. незворотній).

Однак, незважаючи на введення НКТ, експериментальна група показала діарею, хоча і меншої величини (виражену у вазі).

Це можна пояснити існуванням іонних каналів, які не активуються цАМФ, де токсин діятиме безпосередньо. Крім того V. холера продукує інші токсини, такі як Zone Occludens Toxin (ZOT), що збільшує проникність між ентероцитами, та ті, що опосередковують дію простагландинів та нейромедіаторів, що посилюють перистальтику кишечника (9).

Таким чином, ми експериментально продемонстрували корисність НКТ у втраті рідини через холеру у новозеландських кроликів, і ми впевнені, що більш поглиблене вивчення цього нового терапевтичного засобу сприятиме сучасній схемі лікування, яка зробила дуже важливим прогрес у цій галузі минулого століття.

ВДЯКА

Щиро дякуємо за поради, надані д-ром Хосе Чумпітазом з Інституту тропічної медицини імені Даніеля А. Карріана - UNMSM.