реферат
Ген рецептора активіну типу II (ACTRII) мутує у 58,1% мікросателітних нестійких (MSI-H) колоректальних карцином і є близьким родичем рецептора TGFβ-1 типу II, який, як відомо, бере участь у MSI-H та не - MSI-H колоректальний канцерогенез. Тому ми прагнули визначити, чи був ACTRII залучений до колоректального раку, що не є MSI-H. Ми оцінили інактивацію ACTRII шляхом делеції алелів, втрати експресії мРНК або соматичної мутації в 51 карциномі товстої кишки, що не є MSI-H. Втрата гетерозиготності (LOH) у локусі ACTRII (2q23,1) була виявлена у 9 (17,6%) 51 первинної пухлини. Втрата експресії мРНК ACTRII спостерігалася в одній (14,3%) із семи LOH-позитивних первинних пухлин, з яких була загальна РНК. Ми також провели аналіз послідовності ДНК пухлин, що демонструють LOH. Одна первинна LOH-позитивна пухлина продемонструвала зміну зародкової лінії (заміщення амінокислот, 117 Ile до Phe), яка не була виявлена у 23 інших нормальних людей, що вказує на те, що ця зміна не є загальним поліморфізмом. Ми прийшли до висновку, що ACTRII, ймовірно, бере участь у колоректальному канцерогенезі не-MSI-H та MSI-H, але частіше у другій підгрупі.
Головний
Колоректальний рак є другою провідною причиною смертності від раку в Сполучених Штатах і третьою за поширеністю раком обох статей, із 135 400 нових випадків та 56 700 смертей у 2001 році (Американське ракове товариство, 2001). Тому важливо виявити та краще зрозуміти молекулярні шляхи, що лежать в основі цього типу раку, включаючи ідентифікацію нових генів-супресорів пухлини, а також механізмів, що беруть участь у їх інактивації.
Ген-рецептор активіну типу II (ACTRII) був ідентифікований мутаційним скринінгом загальногеномних мутацій як новий ген-супрессор пухлини, що мутував дуже часто (у 58,1% колоректальних карцином MSI-H, тобто пухлин з високою мікросателітною нестабільністю) при ( A) 8 мононуклеотидів повторюється в його кодуючій області (Mori et al, 2001). ACTRII є членом сімейства рецепторів трансформуючого фактора росту β (TGF-β) і асоціюється із сигнальним шляхом активіну-SMAD, який, у свою чергу, бере участь у індукуванні диференціації, придушення росту та апоптозу в різних типах клітин, включаючи похідні з кишкового епітелію (Attisano et al, 1996; Sonoyama et al., 2000). Втручання в сигнальний шлях ACTRII пригнічує диференціювання клітин in vitro (Li et al., 1998; Liu et al., 2000) та апоптоз (Chen et al., 2000; Choi et al., 2001). Сигнальний шлях TGF-β-SMAD, який розділяє низхідні ефектори SMAD2 і SMAD4 із шляхом активіну-SMAD, відповідає за придушення пухлини людини (Attisano et al., 1996; Liu et al., 2000; Sonoyama et al., 2000; Су та ін., 2001). ACTRII утворює активний комплекс гетеродимерних рецепторів з ACTRI (Attisano et al, 1993). Цікаво, що нещодавно соматична мутація ACTRI була описана при раку підшлункової залози (Su et al, 2001).
Щоб визначити, чи брав участь ACTRII у всіх колоректальних пухлинах, а не в тих, що мали часту нестабільність мікросателіта, ми вивчали інактивацію ACTRII у пухлинах, що не є MSI-H. Ми провели детальні дослідження втрати гетерозиготності (LOH) 2q22.1-q23.3, область, що містить ген ACTRII, у 51 колоректальній пухлині, що не є MSI-H. LOH-позитивні пухлини додатково тестували на соматичні точкові мутації в ACTRII .
результат
Алелотипування показало, що 17 (33%) 51 колоректальної пухлини виявляли LOH в одному або декількох з чотирьох локусів хромосоми 2q23.1. Ці результати узагальнені в таблиці 1. Локус D2S141 показав найвищий рівень LOH (12 з 27 інформативних випадків або 44,4%). Дев'ять (17,6%) з 51 пухлини мали ЛОГ, що фланкував локус ACTRII: вони включали 7 аденокарцином і 2 аденоми, одна з яких містила високоякісну вогнищеву дисплазію.
Стіл в натуральну величину
Кількісна RT-PCR показала, що одна пухлина повністю не мала експресії мРНК ACTRII (рис. 1). Цю знахідку підтвердили кілька повторних тестів. Секвенування ДНК решти шести пухлин, з яких була доступна РНК, показало, що вона містила одну зміну нуклеотиду (ТТТ на АТТ, заміщення амінокислоти Іле на Фе) в кодоні 117 у позаклітинному домені ACTRII. Ця зміна послідовності також з'явилася у відповідній нормальній вибірці (рис. 2). Крім того, тихий поліморфізм кодону 118 (CCG до CCA) був виявлений у 3 (50%) з 6 первинних зразків пухлини; Встановлено, що цей поліморфізм був описаний раніше (D'Abronzo et al, 1999). Цей поліморфізм також спостерігався у п'яти (62,5%) з восьми досліджених нами клітинних ліній колоректального раку (D'Abronzo et al, 1999). Нарешті, серед цих восьми клітинних ліній ми виявили делецію однієї основи в повторі (A) 8 при кодоні 437 у клітинах SW48, які, як відомо, є MSI-H (Branch et al, 1995).
Експресія гена ACTRII у пухлинах LOH. RT-ПЛР-аналіз втрати гетерозиготності (LOH) + зразки. Це зображення демонструє гелеве зображення продукту RT-PCR для семи LOH-позитивних пухлин. Результати для β-актину RT-PCR представлені як внутрішній контроль. RT-PCR проводили згідно протоколу Invitrogen/Life Technologies. Умови ПЛР були описані раніше (Mori et al., 2001). Верхній, 1100-п.н. фрагмент гена ACTRII; днк, 436-bp RT-PCR продукт гена β-актину. Доріжка 6 являє собою повну відсутність експресії мРНК гена ACTRII .
Повнорозмірне зображення
Зміна послідовності зародкових ліній в ACTRII. Зміна нуклеотидів у кодоні 117. Зміна нуклеотиду з нормального Т (ліворуч) на А (праворуч) у кодоні 117, що призводить до зміни амінокислоти з Іле на Фе у позаклітинному домені рецептора. Цифри показують смислову послідовність, а кодон 117 вказаний на обох панелях. Стрілка вказує на мутований нуклеотид.
Повнорозмірне зображення
обговорення
ACTRII часто мутує при раку прямої кишки MSI-H (Mori et al, 2001). Крім того, відомо, що активін відіграє роль у рості та диференціації клітин кишечника (Attisano et al., 1996; Sonoyama et al., 2000). Нарешті, існують сильні структурні та функціональні подібності між активіновими та TGF-β-рецепторами (Attisano et al., 1993), останні з яких, як відомо, беруть участь як у MSI-H, так і в колоректальному туморогенезі не-MSI-H (Calin et співавт., 2000; Грейді та ін., 1998, 1999; Орімо та ін., 1998). З цих причин ми вивчали соматичні зміни гена ACTRII при колоректальному раку без MSI-H. Виникнення алельної делеції при 2q23,1 у двох аденомах (одна з вогнищевою дисплазією), а також у семи аденокарциномах свідчить про те, що LOH у цьому локусі може виникнути на початку колоректальної неоплазії.
Щоб оцінити, чи делеція одного алелю ACTRII була пов’язана з інактивацією решти алеля, ми провели секвенування ДНК всієї кодуючої області ACTRII у семи LOH-позитивних первинних пухлинах, з яких була доступна РНК, а також у восьми колоректальних ракових клітинах. ліній. Цей мутаційний аналіз показав, на додаток до безшумного поліморфізму кодону 118 у п'яти з восьми клітинних ліній та трьох із шести пухлин, що експресують ACTRII, єдиного пацієнта з новою зміною кодону 117 у пухлині та у відповідних нормальних зразках.
Примітно, що зміна кодону 117 (I117F), виявлена в одній первинній пухлині, раніше не була описана. Щоб визначити, чи I117F представляє мутацію зародкової лінії або поліморфізм, ми секвенували нормальну геномну ДНК від 23 інших осіб, зосередившись на другому екзоні гена ACTRII (що містить кодон 117). Жодна з цих осіб не зазнала такої зміни, припускаючи, що I117F не є загальним поліморфізмом серед загальної популяції.
Для того, щоб дослідити причетність кодону 117 ACTRII до пухлини людини загалом, ми провели пошук літератури. Відомо, що три амінокислоти у позаклітинному домені ACTRII, 42F, 60W та 83F беруть участь у зв’язуванні активіну та інгібіну з ACTRII: мутації цих залишків у повнорозмірному рецепторі спричиняють порушення зв’язування активіну та інгібіну (Gray et al., 2000).
Повна відсутність експресії мРНК ACTRII була виявлена в одній із семи LOH-позитивних первинних пухлин без MSI-H, але ні в одній з восьми клітинних ліній колоректального раку. Можливо, що гіперметилювання промотору спричинило цю відсутність експресії; однак промоторну область для ACTRII неможливо було ідентифікувати в загальнодоступних базах даних послідовностей ДНК, а також не було виявлено острівців CpG вище за течією в геномному локусі ACTRII. Нарешті, мутація кодону 437, що веде до прогнозованого усіченого білка, спостерігалась у SW48, єдиній досліджуваній клітинній лінії колоректальної карциноми, MSI-H.
Ці дані свідчать про те, що генетичні зміни в гені ACTRII (тобто місенс-мутація, повна втрата експресії мРНК та LOH) відбуваються при колоректальному раку, що не є MSI-H, але з меншою частотою, ніж при раку MSI-H. Таким чином, події, які, як вважають, можуть призвести до інактивації ACTRII, трапляються як у колориктальних пухлинах MSI-H, так і в не MSI-H, додатково підтримуючи кандидатуру ACTRII як гена супресора колоректальної пухлини.
Матеріали і методи
Підготовка тканин, вилучення ДНК та РНК
П'ятдесят одна колоректальна карцинома, що не є MSI-H, яка виявляє MSI не більше ніж в одному з п'яти консенсусних місць (BAT 25, BAT 26, D2S123, D5S346 та D17S250), отримані з відповідними нормальними контрольними тканинами. Всі зразки були взяті під час операції або ендоскопії та негайно заморожені в рідкому азоті. ДНК і РНК витягували із заморожених зразків тканин за допомогою набору тканин DNeasy Tissue Kit та RNeasy Mini Kit з компанії Qiagen (Валенсія, Каліфорнія) відповідно до протоколу виробника.
Аналіз розподілу
Для дослідження LOH використовували чотири мікросателітні маркери, розташовані в області 17 Мб на 2q22.1-q23.3, включаючи ген ACTRII (2q23.1): D2S127, D2S151, D2S2299 та D2S141 (табл. 2). Ген ACTRII знаходиться між D2S151 і D2S2299. Реакції ПЛР проводили в загальному обсязі 10 мкл, що містив 20 нг геномної ДНК, 0,5 мкм кожного праймера, 1 х Taq буфера полімерази (Life Technologies, Гейтерсбург, штат Меріленд), 0,1 мМ кожного з dNTP, 1,5 мМ MgCl і 0, 1 МО ДНК-полімерази Taq (Life Technologies). Умови ПЛР були описані раніше (Mori et al., 2001). Десять мікролітрів кожного продукту ПЛР аналізували на автоматизованому секвенсорі ДНК (MegaBace 1000; Amersham LifeSciences/Molecular Dynamics, Саннівейл, Каліфорнія) з використанням програмного забезпечення Genetic Profiler, версія 1.0 (Amersham Life Sciences/Molecular Dynamics). Ми класифікували специфічну для пухлини зміну як LOH, коли вона призвела до зміни більш ніж 50% висоти піку алелі пухлини порівняно з відповідним нормальним значенням.
Стіл в натуральну величину
Мутаційні аналізи
RT-PCR для рівнів експресії та послідовності кДНК.
РНК доступна із семи LOH-позитивних пухлин, а також з восьми клітинних ліній раку прямої кишки (SW480, SW48, Colo320HSR, WiDr, SW620, SW948, Colo201 та Colo32DM). Зворотна транскрипція використовувала 10 мкг загальної іРНК в загальному реакційному об'ємі 20 мкл, що містило 0,5 мкг Oligo dT (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0,1 мМ dNTP суміш (Invitrogen), 4 мкл 5-кратного буфера першої нитки (там само) мкл 0,1 м дитиотреїтолу (Invitrogen) та 1 мкл рекомбінантної РНКази OUT 40 U/мкл інгібітора рибонуклеази (Invitrogen). Протокол ПЛР проводили в загальному обсязі 20 мкл, що містив 1,75 мкл праймера (Invitrogen), 0,1 мМ dA/T/C/GTP, 0,1 мкл ДНК-полімерази Taq (Qiagen) і 10x Taq буфера полімерази (Qiagen). в тих же умовах, що описані в аналізі алелотипу. Внутрішній контроль RT-PCR для гена β-актину складався з того самого протоколу, з праймерами 5 Index-IndexTerm IndexTerm CCA GAG CAA GAG AGG TAT CC-3 ′ і 5′-IndexTerm IndexTerm CTG TGG TGG TGA AGC TGT AG-3 '. Електрофорез ПЛР-продукту проводили на 1,5% агарозному гелі. Аналіз послідовності проводили як на чуттєвих, так і на антисмислових ланцюгах кДНК, отриманих методом RT-PCR.
Аналіз послідовності CDNA.
Послідовні реакції проводили за допомогою набору термінаторів DYEnamic ET (Amersham Pharmacia Biotech) відповідно до протоколу виробника. Електрофорез проводили на приладі MegaBace 1000 (молекулярна динаміка) та аналізували за допомогою програмного забезпечення Sequence Analyzer, версія 2.0 (Amersham Pharmacia Biotech). Послідовності ДНК пухлин або клітинних ліній порівнювали з послідовністю дикого типу ACTRII, отриманою з бази даних Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov). Геномну ДНК з 24 колоректальних раків секвенували на другому екзоні гена ACTRII згідно з протоколом, описаним вище, з використанням праймерів 5'-IndexTerm IndexTerm TTC TCT GCT TAT TTA TAG GAC TG-3 ′ і 5′-IndexTermTTTTTTTTTT TCC AAT CTA CAG TTG AGC -3 ′.
Дякую
Цю роботу частково підтримали гранти DK47717, CA95323, CA85069 та CA63670 та CA77057.