шлунково-кишкового

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • TNBS викликав коліт та погіршення пам’яті у мишей
  • ЕК порушує навчання та порушення пам’яті у мишей
  • LJ ослаблює TNBS або EC-індукований коліт та погіршення пам'яті
  • Склад мікробіоти кишечника порушує TNBS та EC
  • LPS, виділений від EC, прискореного погіршення пам'яті у мишей
  • обговорення
  • методи
  • прирости
  • Архів послідовностей послідовностей
  • Додаткова інформація
  • Документи Word
  • Додаткова інформація

предметів

  • Імунологічна пам’ять
  • інфекція
  • Запальна хвороба кишечника
  • мікрофлора

реферат

Інтенсивні та розгалужені двонаправлені мережі між кишковим мікробіотом та центральною нервовою системою (ЦНС) підтримуються ендокринними, нервовими та імунними шляхами. 1, 2 Вплив стресу, наприклад патогенних мікроорганізмів, стимулює мозок, виділяючи гормони, такі як кортикотропін-рилізинг-фактор, через вісь гіпоталамус-гіпофіз-наднирники, які порушують мікробіотики кишечника, проникність та бар’єрну функцію та збільшують вироблення ендотоксинів, таких як напр ліпополісахариди (LPS). 3, 4 Крім того, ці ендотоксини, які входять до складу бактеріальних хімічних компонентів, стимулюють імунну реакцію кишечника та обмежують секрецію нейромедіаторів серотоніну та катехоламінів. 5, 6, 7 Ці нейромедіатори, цитокіни та гормони сприяють зв’язку між кишковою імунною системою (пов’язаною з кишковим мікробіотом) та ЦНС та підтримують гомеостаз. 5, 6 Порушення регуляції цих сигналів призводить до коліту, аутизму та ожиріння. 8, 9

У цьому дослідженні, оскільки стрес може викликати рівень ЛПС через коліт і оскільки ЛПС може впливати на функцію ЦНС, ми перевірили нашу гіпотезу про те, що індуктори коліту можуть спричинити гастрит та погіршення пам’яті, порушуючи склад мікробіоти кишечника, та досліджували, чи є коливання мікробіотичного складу кишечника, викликані індуктор коліту може посилити коліт та погіршення пам’яті у мишей.

результат

TNBS викликав коліт та погіршення пам’яті у мишей

У цьому дослідженні внутрішньоректальне введення TNBS мишам спричиняло вкорочення товстої кишки, підвищувало активність мієлопероксидази (MPO), індукувало експресію маркерів запалення, включаючи індуцибельну синтазу оксиду азоту та циклооксигеназу-2, та активізувало NF-κB у товстій кишці (рис. ). 1a - ca додаткове зображення S1a в Інтернеті). TNBS пригнічував експресію білків із стиснутими з'єднаннями ZO-1, клаудін-1 та окклюзином у товстій кишці. TNBS збільшив кількість ентеробактерій, особливо кишкової палички (ЕС,> 75% ентеробактерій), але зменшив кількість біфідобактерій та лактобактерій, включаючи Lactobacillus johnsonii (LJ) (рис. 1г, д). Лікування TNBS збільшило вироблення кишкової мікробіоти LPS (рис. 1f). Лікування TNBS додатково підвищувало рівень LPS і TNF-α у крові та рівень TNF-α у кульшовому суглобі (рис. 1g-i). Лікування TNBS також суттєво зменшило поведінку навчання та пам’яті в лабіринті Y та завдання пасивного уникнення (рис. 1j, k). TNBS також індукував активацію NF-κB в гіпокампі та пригнічував експресію нейротрофічного фактора мозку (BDNF) та фосфорилювання зв’язуючого білка елемента відповіді на цАМР (CREB) (рисунок 11 та додатковий малюнок S1b).

L. johnsonii (LJ) ослаблює індукований колітом 2,4,6-тринітробензолсульфокислоти (TNBS) та погіршує пам’ять. Навчання та поведінку пам'яті оцінювали в ролі лабіринту Y ( a ). Експресія мозкового похідного нейротрофічного фактора (BDNF) та активація ядерного фактора (NF) -KB вимірювали в гіпокампі методом імуноблотингу ( b ). Рівні ліпополісахаридів у крові (LPS) вимірювали за допомогою тесту Limulus ( c ). Рівень крові ( d ) та фактор некрозу гіпокампа пухлини (TNF) -α ( e ) вимірювали за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА). Маркери коліту, включаючи вкорочення товстого кишечника ( f ), активність мієлопероксидази товстої кишки (MPO) ( g ) та активація NF-κB та індукована експресія синтази оксиду азоту (iNOS) та циклооксигенази (COX) -2 ( h ) і щільне з'єднання експресії білка i) вимірювали в товстій кишці. Значення вказують на середнє значення ± sd (n = 10). * P

Вплив 2,4,6-тринітробензолсульфонової кислоти (TNBS), кишкової палички (EC) та L. johnsonii (LJ) на кишковий склад мікробіоти у мишей. Вплив на рівень деформації ( a ) та сім'ї ( b ). Співвідношення протеобактерій та твердих речовин (P/F) ( c ), Бактероїдети до твердих речовин (B/F) ( d ) та протеобактерій до бактеріоідів (P/B) ( e ) аналізували шляхом піросеквенування бактеріальних фрагментів 16S рРНК. ( d ). f ) Графік основного координатного аналізу (PCoA). На графіку показано кластеризацію між мишами, які отримували лише носій (NOR), лише TNBS, лише EC, LJ у присутності EC (EC + LJ) на основі зваженого парного експрес-аналізу UniFrac. Вплив на кількість ентеробактерій ( g ) та біфідобактерії + лактобактерії ( h ) вимірювали за допомогою культури селективного середовища. Чорні, сірі та білі стовпці у ( g ) вказують на склад ЕС, K. pneumoniae та P. mirabilis. Значення вказують на середнє значення ± sd (n = 5). * P

методи

Культура кишкових бактерій. LJ та EC, виділені з мікробіоти кишківника мишей, культивували в середовищі GAM (BD, Radnor, PA) та MRS (BD), BL та DHL селективних середовищах (Nissui Pharm, Токіо, Японія). Коротко, LJ та EC культивували в 0,5 л відвару GAM при 37 ° С (оптична щільність при 600 нм, 1,0 - 1, 2), збирали центрифугуванням (5000 г протягом 20 хвилин) і двічі промивали сольовим розчином. Зібрані клітини (5 х 109 КУО мл -1) суспендували у фізіологічному розчині (для клітинних експериментів, нагріванні при 72 ° С протягом 30 хвилин) або 1% глюкози (для перорального введення мишам).

Для аналізу мікробіоти кишечника селективним середовищем вміст свіжої кишки (

0,1 г) з кожної групи збирали в стерилізовані пластикові контейнери, обережно суспендували в 9 обсягах розчинника, послідовно розводили в 10 разів і інокулювали безпосередньо на агарові пластинки середовища печінки крові (BL, Bifidobacteria/Lactobacilli-selective середовище, Nissui Pharm) і водень сульфат-лактозне середовище (DHL, селективне середовище Enterobacteriaceae, Eiken Chem, Токіо, Японія). 41 агаровий планшет DHL культивували аеробно протягом 1 дня при 37 ° C, а агарові планшети BL культивували анаеробно протягом 3 днів при 37 ° C.

LJ та EC були обрані з колоній, які, по суті, вирощувались у BL та DHL, і були ідентифіковані за допомогою фарбування за Грамом, аналізу використання цукру (API 50 CHL або API 20 E Kit, bioMerieux, Сеул, Корея) та послідовності 16S рРНК (ABI). 3730XL Аналіз ДНК). Вони зберігаються у скороченому архіві Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) під номерами підключення KY751910 та KY751911.

Ізоляція LPS від ЕС. LPS витягували, як описано раніше з деякими модифікаціями. Коротко, EC культивували в триптичному соєвому бульйоні (500 мл) протягом 24 годин при 37 ° C і збирали центрифугуванням при 10000 g протягом 5 хвилин. Гранули двічі промивали 0,15 М сольовим розчином, забуференним фосфатом (PBS, рН 7,2), що містить 0,15 мМ CaCl 2 і 0,5 мМ MgCl 2, суспендували в 50 мл PBS і обробляли ультразвуком протягом 30 хвилин на льоду. Ультразвук інкубували з протеїназою К (100 мкг мл-1, Sigma, Сент-Луїс, Міссурі) при 65 ° С протягом 2 годин, а потім обробляли РНКазою (40 мкг мл-1, Sigma) та DNase (20 мкг мл- 1) .1) Sigma) у присутності 1 мкл/мл 20% MgSO 4 та 4 мкл мл -1 хлороформу при 37 ° С протягом ночі. Реакційний розчин екстрагували рівним об'ємом 90% фенолу при енергійному струшуванні при 65-70 ° С протягом 15 хвилин, переносили в поліпропіленові пробірки і центрифугували при 8500 г протягом 15 хвилин. Супернатанти обробляли 10 обсягів 95% холодного етанолу у присутності 0,5 М ацетату натрію при -20 ° C протягом ночі та центрифугували при 2000 g при 4 ° C протягом 10 хвилин. Отриману гранулу суспендували в дистильованій воді, двічі діалізували проти подвійної дистильованої води при 4 ° С, потім ліофілізували і використовували як LPS у цьому експерименті.

Культура клітин Caco-2. Клітини Caco-2 купували у Korea Cell Line Bank (Сеул, Корея) і культивували при 37 ° C в атмосфері 5% CO 2 - 95% повітря в DMEM (Sigma), що містить 10% плодової бичачої сироватки та 1% антибіотиків. Для вимірювання впливу ЖЖ на експресію тісно зв’язаних білків in vitro клітини обробляли 100 нг мл-1 фракції ЛПС у калі в присутності або відсутності ЖЖ протягом 24 годин та рівні експресії фіксованих білків у своїх клітинах. лізат вимірювали за допомогою імуноблотингу.

Тварини. Самці мишей ICR (25-27 г, 5 тижнів) отримували з RaonBio. (Кенгі-до, Корея). Всіх мишей поміщали в дротяні клітки при температурі 20-22 ° C і вологості 50 ± 10%, годували стандартною лабораторною чау і водою ad libitum. Мишей використовували в експериментах після акліматизації більше 1 тижня. Кожна група у всіх експериментах складалася з 10 мишей.

Усі експерименти на тваринах були схвалені Комітетом з догляду та використання лабораторних тварин Університету Кюнг Хі та проводились відповідно до Керівних принципів догляду та використання лабораторних тварин Університету Кюнг Хі (номер IRB KHUASP (SE) -15-092).

Підготовка експериментальних мишей від коліту. Щоб підготувати мишей з індукованим TNBS колітом, 2,5% (мас./Об.) Розчину TNBS (100 мкл, розчинений у 50% етанолі) вводили внутрішньоректально в товсту кишку мишей під ефірною ефірною анестезією ефіром 43 (додатковий малюнок S6a). Щоб повністю розподілити TNBS у товстій кишці, мишей утримували у вертикальному положенні протягом 30 с після обробки TNBS. Звичайну контрольну групу лікували фізіологічним розчином замість TNBS. Мишей вбивали через 24 години, 8-й день та 15-й день після лікування TNBS.

Для приготування індукованого ЕК коліту мишам перорально вводили суспензію ЕК (1 × 10 9 КУО, суспендовану в 100 мкл 1% глюкози) один раз на день протягом 5 днів (додатковий малюнок S6b). Нормальну контрольну групу лікували 1% глюкозою замість ЕК. Мишей вбивали через 24 год, 8-й день та 15-й день після лікування ЕК.

Для приготування погіршення пам'яті, спричиненого LPS, мишам вводили внутрішньочеревно розчин LPS (8 мкг кг -1, розчинений у фізіологічному розчині) один раз на день протягом 10 днів (Додаткова фігура S6c). LPS був ізольований від EC. Нормальну контрольну групу лікували 1% глюкозою замість ЕК. Мишей вбивали через 48 годин після остаточного введення ЛПС.

Завдання пасивного уникнення. Завдання пасивного уникнення виконувалося в акриловій коробці з двома відділеннями, з’єднаною освітленим відділенням (20 × 20 × 20 см) із темним відділенням (20 × 20 × 20 см) за допомогою вхідного отвору (5 × 5 см) відповідно до методу Юнга та ін. 44 Коротко, у дослідженні придбання миші поміщали в освітлене відділення на 1-й, 8-й і 15-й день після обробки TNBS, EC або його LPS, і коли миша потрапляла в темну камеру, ток струму 0,3 мА протягом 2 с давали через підлогові сітки. Випробування на утримання проводили через 24 години після випробування на придбання та вимірювали час затримки для повторного входу в темну камеру.

Завдання Y-лабіринт. Y-лабіринт виконували в горизонтальному лабіринті з трьома руками (довжиною 40 см і шириною 3 см зі стінками висотою 12 см), в якому руки симетрично розташовані під кутом 120 ° один від одного згідно з методом Jung et ін. 44 Лабіринтну підлогу та стіни виготовляли з темного непрозорого полівінілового пластику. Спочатку мишу поміщали в одну руку на 1-й, 8-й і 15-й день після обробки TNBS, EC або його LPS, а послідовність (тобто ACABC та ін.) Та кількість записів у руки реєстрували автоматично для кожної миші протягом 8 хв. Фактичне чергування було визначено як входження у всі три групи за послідовним вибором (тобто ABC, CAB або BAC, але не ABA). Руки лабіринту ретельно очищали між завданнями, щоб видалити залишковий запах. Чергування (%) вказувалося наступним чином: чергування (%) = [(кількість чергувань)/(кількість загальних входів у руки - 2)] × 100. Кількість входів у руки, що слугувало показником рухової активності.

Аналіз активності MPO. Товсту кишку миші гомогенізували в 10 м М фосфатному буфері калію (рН 7,0), що містить 0,5% гексадецилтриметил амонію броміду, і центрифугували протягом 10 хв при 20000 г при 4 ° C. 45 Супернатант (50 мкл) додавали до реакційної суміші (0,1 м MH 2 O 2 та 1,6 м М тетраметилбензидину), інкубували при 37 ° C протягом 2 хв, а потім періодично контролювали поглинання при 650 нм протягом 5 хв. Активність МРО розраховували як кількість ферменту, що розкладає 1 мкмоль мл -1 перекису, і виражали в одиниці на мг білка.

Імуноферментний аналіз та імуноблотинг. Товсту кишку миші або гіпокампу гомогенізували в буфері для лізису RIPA, що містить 1% коктейлю інгібітора фосфатази та 1% коктейлю інгібітора протеази на льоду, і центрифугували при 15000 g при 4 ° C протягом 15 хв. Культивовані клітини Caco-2 гомогенізували в буфері для лізису RIPA, що містить 1% коктейлю-інгібітора фосфатази та 1% коктейлю-інгібітора протеази на льоду. Рівні цитокінів у супернатантах вимірювали за допомогою набору імуноферментних аналізів (Ebioscience, Atlanta, GA).

Для імуноблотингу супернатанти гомогенатів товстої кишки та культивованих клітин піддавали електрофорезу в SDS-поліакриламідному гелі та переносили на нітроцелюлозну мембрану. 45 Білки зондували антитілами, виявляли кон'юговані з пероксидазою хрону вторинні антитіла та візуалізували за допомогою набору для виявлення ECL.

Аналіз лізату амебоцитарних лізатів. Вміст ендотоксину в крові та фекаліях визначали за допомогою діазо-зв’язаного кінцевого лізату амебоцитарних лізатів (Cape Cod, E. Falmouth, MA) за методом Kim et al. 41 Коротко кажучи, для визначення концентрації ендотоксину в крові плазму розводили у безпірогенній воді в 10 разів, інактивували при 70 ° C протягом 10 хв, а потім інкубували з лімулом амебоцитарного лізату протягом 30 хв при 37 ° C. Додавання реагентів призвело до утворення похідного фуксину, який поглинає світло при 545 нм.

Для визначення концентрації ендотоксину в калі 20 мг калу з товстої кишки поміщали в 50 мл PBS в безпірогенну пробірку і обробляли ультразвуком на 1 год на льоду. 41 Після центрифугування при 400 g протягом 15 хв збирали верхні 30 мл, стерилізували фільтруванням через фільтр 0,45 мкм з наступною повторною фільтрацією через 0,22 мкм фільтр і інактивували протягом 10 хв при 70 ° С. Відфільтрований ультразвук використовували для визначення ендотоксину.

Статистичний аналіз. Дані вказуються як середнє значення ± sd Статистичний аналіз даних проводили з дисперсійним аналізом та тестом Дункана. Відмінності з Р