- Предмети
- Резюме
- Вступ
- Результати
- HuR взаємодіє з XIAP IRES
- HuR зв'язується безпосередньо з РНК IRES XIAP
- Клітинні рівні HuR модулюють активність XIAP IRES
- Клітинні рівні HuR модулюють трансляцію ендогенної мРНК XIAP
- Індукція XIAP, опосередкована HuR, захищає клітини від індукованої етопозидом загибелі клітин
- Обговорення
- Додаткова інформація
- Файли зображень
- Додаткова фігура 1
- Документи Word
- Додаткова легенда фігури
Предмети
- Клітинна загибель
- РНК-зв’язуючі білки
- Переклад
Резюме
Експресія власного інгібітора клітинної каспази XIAP регулюється головним чином на рівні синтезу білка. У 5 'нетранслируемой області міститься внутрішній мотив місця вступу рибосоми (IRES), який підтримує незалежну трансляцію трансляції мРНК XIAP під час клітинного стресу. У цьому дослідженні ми показуємо, що РНК-зв’язуючий білок HuR, який, як відомо, організовує антиапоптотичну клітинну програму, стимулює трансляцію мРНК XIAP через IRES XIAP. Крім того, ми показуємо, що HuR зв'язується з XIAP IRES in vitro та in vivo та стимулює рекрутування мРНК XIAP у полісоми. Важливо, що захист агента, що індукує апоптоз, етопозиду шляхом надмірної експресії HuR, вимагає присутності XIAP, що свідчить про те, що опосередкована HuR цитопротекція частково виконується завдяки посиленому трансляції XIAP. Наші дані свідчать про те, що XIAP належить до HuR-регульованого РНК-оперону антиапоптотичних генів, який разом з Bcl-2, Mcl-1 та ProTα сприяє регуляції виживання клітин.
Вступ
Х-зчеплений інгібітор апоптозу (XIAP) є прототипом члена інгібітора сімейства білків апоптозу. XIAP виконує кілька різних функцій всередині клітини, включаючи модуляцію опосередкованої рецепторами передачі сигналу, убіквітінацію білка, і головним чином пряме інгібування каспази і, таким чином, регулювання виживання клітин (оглянуто в Liston et al., 2003; Dubrez-Daloz et al., 2008) Хоча мутації, які пов'язують XIAP з онкогенною трансформацією, не були описані, підвищений рівень XIAP повідомлявся при різних типах раку і асоціювався з підвищеною стійкістю до хіміотерапії та опромінення (Tamm et al., 2000, 2004a, 2004b; Holcik et al., 2000b; Yoon et al., 2006; Gu et al., 2009). Терапевтичний потенціал спрямованості на експресію XIAP нещодавно був продемонстрований у кількох клінічних випробуваннях (Schimmer et al., 2005, 2009; Dean et al., 2007, 2009).
Клітинні рівні XIAP регулюються кількома різними механізмами, але переважна регуляція, як видається, знаходиться на рівні ініціації трансляції (Holcik, 2003). У 5 'нетранслируемой області (5' UTR) мРНК XIAP міститься мотив внутрішнього місця входу в рибосому (IRES), який керує ефективною трансляцією мРНК XIAP в умовах клітинного стресу, коли глобальна трансляція залежить від шапки (Holcik et al., 1999; Yoon et al., 2006; Gu et al., 2009). Трансляція клітинних мРНК, керована IRES, нещодавно стала важливим регулятором селективної трансляції, особливо в умовах гіпоксії, ендоплазматичного стресу або сироваткового голодування (Holcik et al., 2000a; Holcik and Sonenberg, 2005). Ці стани часто є в пухлинах, і багато ракових клітин вимагають опосередкованого IRES трансляції специфічних мРНК для свого виживання (Braunstein et al., 2007; Silvera et al., 2009). Незважаючи на те, що виявлено перехід від залежного перекладу до IRES (Braunstein et al., 2007), точні механізми та когорта клітинних білків, що сприяють регуляції IRES-залежного перекладу, незрозумілі.
XIAP IRES має довжину 162 нуклеотиди і утворює чітку структуру РНК (Baird et al., 2007). Раніше ми охарактеризували послідовність та структурні атрибути XIAP IRES (Holcik et al., 1999; Baird et al., 2007), і ми почали з'ясовувати механізм, що регулює його діяльність. Ми та інші визначили IRES фактори дії (ITAF), клітинні білки, які специфічно зв'язуються з IRES XIAP та регулюють його. Цікаво, що хоча деякі з цих факторів стимулюють функцію XIAP IRES (Аутоантиген (Holcik and Korneluk, 2000); hnRNP C1/C2 (Holcik et al., 2003); mdm2 (Gu et al., 2009)), інші роблять це т. репресія (hnRNP A1 (Lewis et al., 2007); PTB (Baird et al., 2007)). Однак природа комплексу рибонуклеопротеїнів IRES XIAP (RNP) та ідентичність усіх XIAP ITAF залишаються невідомими.
У цій роботі ми використовували афінну хроматографію РНК РНК XIAP для виявлення HuR як нового XIAP ITAF. Ми виявили, що HuR зв’язується з XIAP IRES in vitro та є частиною комплексу XIAP-IRES-RNP in vivo. Крім того, HuR стимулює трансляцію ендогенної мРНК XIAP, що сприяє збереженню життєздатності клітин в опосередкованій етопозидом моделі загибелі клітин.
Результати
HuR взаємодіє з XIAP IRES
Повнорозмірне зображення
Потім ми оцінюємо, чи асоціюється ендогенний HuR з ендогенною мРНК XIAP у клітинах. Ми імунопреципітували РНК-білкові комплекси, використовуючи HuR, IgG (негативний контроль) або TIA-1/TIAR (відомий РНК-зв’язуючий білок) антитіла з білкових екстрактів в умовах, що зберігали РНК-білкові комплекси, як описано вище (Lewis et al., 2007). З цих імунопреципітатів виділяли РНК, а комплементарну ДНК (кДНК) продукували шляхом зворотної транскрипції з подальшою ампліфікацією ПЛР за допомогою специфічних для послідовності праймерів, що кодують XIAP та β-актин. Ми не змогли ампліфікувати будь-яку значну кількість XIAP від імунопреципітації IgG або TIA-1/TIAR (рис. 1в, смуги 3 та 4). Однак імунопреципітація антитілами проти HuR спільно осаджує мРНК XIAP (рис. 1в, смуга 2), підтверджуючи, що ендогенний HuR асоціюється з ендогенною мРНК XIAP у клітинах in vivo. Ми не змогли посилити транскрипт великої кількості β-актину з наших імунопреципітатів будь-яким з антитіл, що вказує на те, що наша коіммунопреципітація мРНК XIAP є специфічною. Хоча повідомлялося, що HuR асоціюється з транскрипцією β-актину (Dormoy-Raclet et al., 2007), ми не могли підтвердити цю асоціацію.
HuR зв'язується безпосередньо з РНК IRES XIAP
HuR містить три мотиви розпізнавання РНК (RRM), з яких RRM1 і RRM2 беруть участь у зв'язуванні РНК, тоді як RRM3 необхідний для спільного збирання олігомерів HuR в РНК, але мінімально сприяє зв'язуванню РНК (Fialcowitz-White et al., 2007). Ми перевірили, використовуючи експерименти з УФ-зшиванням з мутантами делеції HuR (Mazroui et al., 2008), чи це також стосується зв’язування HuR з IRES XIAP. Очищений AP-HuR-GST (повнорозмірний HuR), AP-HuR (CP1) -GST (що містить RRM1 та RRM2) або AP-HuR (CP2) -GST (що містить RRM3) інкубували з XIAP з міткою [32 P] РНК IRES з подальшим ультрафіолетовим зшиванням та розділенням за допомогою SDS-PAGE. Ми виявили, що RRM1 та RRM2 необхідні для зв’язування HuR із XIAP IRES (додатковий малюнок 1А), вказуючи на те, що механізм зв’язування HuR з РНК XIAP IRES подібний до інших цільових РНК HuR. Крім того, ми перевірили здатність цих конструкцій видалення модулювати активність XIAP IRES (див. Нижче).
Клітинні рівні HuR модулюють активність XIAP IRES
50% в активності XIAP IRES порівняно з контролем, що не мовчить (Рисунок 2b). Ці спостереження свідчать про те, що HuR має стимулюючу активність ITAF для IRIS XIAP. Альтернативним поясненням наших спостережень може бути те, що HuR впливає на цілісність репортерної транскрипту біцистронної РНК, змінюючи, таким чином, співвідношення CAT до β-gal білка. Тому ми визначили вплив модуляції рівнів HuR на транскрипційну цілісність біцистронної РНК β-gal/(- 162)/CAT, використовуючи кількісну зворотну транскриптазу-ПЛР, як описано раніше (Holcik et al., 2005). Загальну РНК виділяли з трансфікованих клітин, а додаткову ДНК продукували шляхом зворотної транскрипції. Кількісну ПЛР проводили з використанням праймерів, які ампліфікують частину кодуючої області β-gal та частину кодуючої області CAT. Як показано на малюнку 2c, частка CAT і β-gal цистронів не змінювалася в клітинах, незалежно від стану експресії HuR.
Повнорозмірне зображення
Клітинні рівні HuR модулюють трансляцію ендогенної мРНК XIAP
Ми показали, що HuR пов'язує та позитивно регулює діяльність XIAP IRES. Потім ми досліджуємо, чи впливають клітинні рівні HuR на трансляцію ендогенної мРНК XIAP. Клітини HEK293T тимчасово трансфікували плазмідою, що експресує GFP або GFP-HuR, а ендогенні рівні XIAP визначали за допомогою вестерн-блот-аналізу через 24 години після трансфекції. Ми виявили, що надмірна експресія GFP-HuR спричинила збільшення у 2 рази рівня білка XIAP порівняно з контролем GFP (рис. 3а), без супутнього збільшення рівнів мРНК XIAP (рис. 3b). В зворотному експерименті клітини HEK293T трансфікували з контрольним націлюванням siRNA або без мовчання HuR, а рівні білка XIAP визначали через 48 годин за допомогою Вестерн-блот-аналізу. Ми виявили, що зниження рівня HuR за допомогою siRNA призвело до зменшення
50% рівнів білка XIAP порівняно з контролем без мовчання (рис. 3в), хоча він не впливав на рівні мРНК XIAP (рис. 3b). Ці спостереження паралельно з тим, що ми бачили, з побудовою репортера XIAP IRES (рис. 2), припускаючи, що HuR є позитивним регулятором трансляції XIAP, модулюючи функцію XIAP IRES.
Повнорозмірне зображення
Щоб далі продемонструвати, що HuR насправді впливає на трансляцію ендогенної мРНК XIAP, ми використовували полісомне профілювання, щоб дослідити зв'язок мРНК XIAP з трансляцією рибосом у клітинах, що надмірно експресують HuR. Ми спостерігали, що надмірна експресія HuR призвела до незначної втрати важких полісом та збільшення моносом (рис. 3г), що свідчить про пригнічення глобального синтезу білка. Це спостереження було досить дивовижним, оскільки HuR, як відомо, не впливає на загальні показники синтезу білка. Однак ампліфікація зворотної транскриптази-ПЛР мРНК XIAP з окремих фракцій показала, що, незважаючи на зменшення загального синтезу білка, мРНК XIAP рекрутується у важчі полісоми клітин, які надмірно експресують HuR, підтверджуючи, що трансляція мРНК XIAP посилюється HuR.
Індукція XIAP, опосередкована HuR, захищає клітини від індукованої етопозидом загибелі клітин
Надмірна експресія HuR захищає клітини від індукованої етопозидами загибелі клітин у залежності від XIAP. Клітини HEK293T реверсували зворотною транссенсією за допомогою контролера, що не глушить (CTRL), або siRNA, націленого на XIAP, і через 24 години плазмідою, що експресує GFP або GFP-HuR. Через 24 год після трансфекції клітини обробляли зазначеними дозами етопозиду протягом 24 год, а життєздатність клітин визначали за допомогою аналізу блакитного аламару. Середнє значення ± sem (бари) двох незалежних експериментів, проведених у трьох примірниках (* P