бути

Молекулярна біологія, білки

П’ять практичних прийомів, щоб бути експертом із західних плям

Вестерн-блот (WB) досі є найбільш широко використовуваним методом розділення та виявлення білків, і, незважаючи на це, все одно нудно доводити кожен експеримент досконало. Оптимізація нашого експерименту має вирішальне значення, і такі фактори, як: якість антитіла, блокуючі буфери або ефективність передачі, є ключовими кроками для досягнення успіху в процесі.

Ми детально проаналізуємо, які поради та інструменти дозволять нам покращити наші результати.

1. Завантажте потрібну кількість білка

Кількість білка, що завантажується в кожну лунку, становить змінна і він повинен бути оптимізований дослідником, оскільки це фактор, який залежить від рівні виразу цього гена в цій тканині. Крім того, слід враховувати, який обсяг вибірки визнає та чашка. Однак між 10 Y 50 мкг білок з гомогенату тканини та між ними 10 Y 100 нг загального білка в очищених зразках зазвичай достатньо.

2. Чи потрібно мої зразки зменшувати чи денатурувати?

Перегляд технічного паспорта антитіла є важливим, щоб знати, як нам слід готувати наші зразки. Як правило, зразки для СБ - це білки денатурований. Рідні білки мають третинну структуру, і їх конформація відводить фундаментальну роль у функція білка. Однак ця структура вплине на міграція цих білків через пори поліакриламід. Денатурацію білка можна зробити:

  • Додецилсульфат натрію (SDS), є миючим засобом, що використовується для розриву водневих зв’язків та розбирання третинної структури.
  • Відновники, такі як b-меркаптоетанол або дитиотреїтол (DTT) для зменшення дисульфідних містків між цистеїнами.
  • Тепло зразки до 100ºC для денатурації та полегшення зв'язку SDS.


3. Як уникнути страшних смуг «смайликів» та «плям» ?

Якщо наша мембрана представляє ці «смужки смайлів», можливо, електрофорез слід було провести надто швидко або зразки стали занадто гарячими. Рекомендується ще одна міграція повільний під час більше часу а по можливості в холодний.

Іноді вони можуть з’являтися плями білий в нашому плямі в результаті бульбашки повітря, що потрапив під час процесу передачі. Щоб уникнути цієї надокучливої ​​проблеми, ми рекомендуємо використовувати конічну трубку об’ємом 50 мл на наборі для перенесення з ідеєю позбутися залишкове повітря між поліакриламідним гелем та нітроцелюлозною або PVDF-мембраною.

4. Чи існує різниця між блокуванням БСА або молоком?

Після перенесення білка з поліакриламідного гелю на мембрану він є суттєвий блокувати ті точки мембрани, які не містять ліганд, щоб зменшити фон або неспецифічне зв’язування антитіла з мембраною.

Для нас це більше рекомендується дотримуйтесь порад, зазначених виробником, оскільки зазвичай антитіл може бути дуже чутливий тип використовуваного блокуючого агента.

Загалом, блокування бичачим сироватковим альбуміном (BSA) забезпечує чіткіші результати, оскільки цей білок має нижчу перехресну реакційну здатність. Крім того, використання BSA показано в тих ляпках, в яких ми хочемо виявити білки фосфорильований.

Однак багато антитіла краще працюють з ними молоко знежирене, оскільки воно містить широкий спектр блокуючих агентів.

5. Яке розведення первинного антитіла я повинен використовувати?

Оптимальна концентрація антитіла - це та, за допомогою якої ми отримуємо хороший сигнал з мінімальним фоновим шумом. Очевидно, що для економії грошей ідеально розбавляти наше антитіло до тих пір, поки сигнал буде достатнім.

Однак для нових антитіл доцільно зробити банку для розведення, щоб знати, яке розведення найкраще пристосоване до цього білка в цій тканині. Наприклад, якщо виробник пропонує розведення 1: 200, ми можемо перевірити розведення 1:50, 1: 100, 1: 500 або навіть 1: 1000.

У випадку, якщо ми не маємо додаткової інформації про розведення, яке ми використовуємо, ми можемо орієнтуватися згідно з цими параметрами:

  • супернатант з культури клітин: приблизно 1:10
  • асцит: 1: 100
  • загальна антисироватка: від 1:50 до 1: 100
  • очищене антитіло: 5 мкг/мл

Ознайомтесь із усіма рішеннями для вестерн-блот, які пропонує вам Labclinics

Genetex пропонує вам вибір продуктів, пов’язаних із вестерн-блот (електрофорез, перенесення, блокування тощо).