предметів
реферат
Раніше наша група продемонструвала сильний зв’язок між підвищенням активності ферменту CD13 у плазмі крові та нещодавно діагностованою екстенсивною хронічною РТПХ (cGVHD) у дітей. Оскільки після трансплантації крові та кісткового мозку (BMT) зафіксовано цитотоксичні анти-CD13 Abs у зв'язку з CMV та cGVHD-інфекцією, ми припустили, що розчинний CD13 сприяє патогенезу cGVHD, викликаючи CD13 реактивний Abs, і що анти-CD13 Abs може бути додаткові біомаркери для нещодавно діагностованого екстенсивного cGVHD. Використовуючи проспективно зібрані зразки плазми педіатричних алогенних пацієнтів з BMT (ало-BMT) із cGVHD та контролем без cGVHD, включених у велике терапевтичне дослідження з багатьма установами дитячої онкологічної групи cGVHD, ми оцінили, чи розчинний CD13 корелює з індукцією Abs-CD13 . Ми виявили, що CD13 реактивний Ab присутній у частці пацієнтів після ало-BMT, але, схоже, не корелює з наявністю розчинного CD13. Анти-CD13 Abs також не відповідав нашим критеріям як діагностичний біомаркер для cGVHD. Ці дані не підтверджують, що індукція CD13 реактивного Abs є механізмом розвитку cGVHD у дітей, а також не є частиною патогенезу cGVHD, пов'язаного зі збільшенням розчинного CD13. Точна роль CD13 у cGVHD ще повинна бути визначена.
Матеріали і методи
предметів
Зразки периферичної крові були зібрані та оцінені проспективно у суб'єктів, залучених до дитячого онкологічного клінічного випробування ASCT0031, рандомізованого, плацебо-контрольованого, подвійного сліпого дослідження фази III, яке оцінювало дві схеми лікування для педіатричних пацієнтів з нещодавно діагностованою великою СГВГД, як описано вище. 7 пацієнтів, зареєстрованих та пролікованих за ASCT0031, сформували експериментальну групу (n = 52). Для контролю відновлення імунної системи після ало-BMT було проведено порівняння за часом з контрольною групою (n = 28) для суб'єктів із cGVHD, а дні після ало-BMT під час діагностики cGVHD використовували для поділу експериментальної групи на початкову cGVHD (3-8 місяців після трансплантації) або пізній початок cGVHD (
9 місяців після трансплантації) та порівняно з контрольними пацієнтами без ІМТ без cGVHD з 6 (ранній) та 12 місяців (пізній) після БМТ. Для порівняння оцінювали здоровий добровільний контроль нетрансплантованих донорів крові (n = 6).
Оцінені зразки
Периферичну кров відбирали у пацієнтів із СГВГД під час вступу в дослідження (час діагностики СГВГД) та у контрольних суб’єктів, зібраних через 6 та 12 місяців (після трансплантації). Зразок поділяли на клітини та плазму після центрифугування та зберігали при -80 ° C. Заморожену плазму розморожували на водяній бані з температурою 37 ° C та ультрацентрифугували (15000 об/хв протягом 5 хвилин), щоб видалити осад, коли він готовий до використання. Після нашого попереднього аналізу біомаркерів 7, у меншості пацієнтів не було достатнього обсягу плазми для аналізу на анти-CD13 Ab, і вони не були включені в цей аналіз. Достатня плазма була доступна для аналізу на анти-CD13 Ab (45 зразків cGVHD та 26 контрольних аналізів ELISA; 42 зразки cGVHD та 23 контролі Cellomics, Пітсбург, Пенсільванія, США).
Розчинний ферментативний аналіз CD13 (амінопептидази N)
Зразки плазми аналізували на активність розчинного CD13 (амінопептидази N), як описано вище. 7 Результати розчинної активності CD13, опубліковані в нашій групі 7, використовувались для кореляційних досліджень проти анти-CD13 Abs.
ІФА для анти-CD13
Виступ для анти-CD13
Зразки (30 мкл) розводили 1: 5 у PBS (120 мкл) і додавали до 96-лункових планшетів, що містять нетрансфіковані ендотеліальні клітини гемангіоендотеліоми миші (клітинна лінія EOMA), та інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі для зменшення неспецифічного зв'язування Пластини центрифугували (800 об/хв протягом 5 хвилин) і збирали 100 мкл супернатанту. Супернатант додавали до 96-лункових планшетів, що містять трансфіковані плазмідою клітини EOMA, що експресують людський CD13 Ag, і інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі. Потім лунки промивали три рази PBS і додавали кон’югований FITC мишачий анти-людський Ig (специфічний для IgG людини) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada), інкубували протягом 30 хвилин і промивали PBS. В якості позитивного контролю використовували MoAb WM15 (розведення 1:50 з використанням 2 мкл WM15 і 98 мкл PBS), а в якості негативного контролю використовували ізотип MoAb IgG 1 миші (Ancell, Bayport, MN, USA) з подальшим кон'югованим FITC анти- мишачий IgG 1. Для виявлення ДНК клітини EOMA використовували барвник HOECHST 33342 (Sigma-Aldrich) при 1 мкг/мл. Інтенсивність FITC кожної лунки зчитувалася з ArrayScan Reader 4.5 (Cellomics) та середня інтенсивність FITC на клітинку, що використовується як маркер анти-CD13 Abs.
Статистичний аналіз
Як визначено вище, Abs-CD13 Abs вважалися біологічно та клінічно значущими, якщо були дотримані наступні два критерії: (1) на 100% вище або на 50% нижче порівняно з контролем (± 5%) та (2) статистична значимість з P- значення 7 Описова статистика була сформована для всіх даних за допомогою Prism версії 5 для ПК (GraphPad Software, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) або SPSS (версія 15.0, Чикаго, Іллінойс, США). Значимість спостережуваних змін визначали за допомогою t-критерію Стьюдента та 95% довірчих інтервалів вираженої різниці. Усі значення P 
Порівняння анти-CD13 Abs з використанням ( a ) ІФА a ( b ) Келоміка між предметними групами (P = NS для всіх). ІФА використовував свинячий CD13 як Ag та OD для вимірювання відносного анти-CD13 Ab. У целомичному аналізі використовували CD13 людини як Ag та середню інтенсивність FITC на клітину для вимірювання відносного анти-CD13 Ab.
Повнорозмірне зображення
Деякі зразки як cGVHD, так і контрольних зразків у тесті Cellomics мали високий рівень анти-CD13 порівняно зі здоровими добровольцями (рис. 1b). Використовуючи позитивну межу анти-CD13 як середню інтенсивність FITC на клітину плюс 2 сд для здорових добровольців, ми не виявили значущої різниці в позитивній абсорбції анти-CD13 між ранніми cGVHD (14 з 32, 44%) та ранніми контролями (5 з 5) 22, 23%) (різниця 21%; 95% довірчий інтервал: -3,5 до + 45,6%). Подібним чином не було значної різниці у пізніх СГГВ (7 з 10, 70%) порівняно з пізнім контролем (5 з 12, 42%) (різниця 28%; 95% довірчий інтервал: -11,5 до + 68,1%). Не виявлено зв'язку між Abs-CD13 Abs (позитивним чи негативним) та гострими РТПХ в анамнезі, а також будь-яким конкретним місцем ураження cGVHD (шкіра, оральний, очний, шлунково-кишковий, печінковий, легеневий або опорно-руховий апарат) (дані не наведені).
Кореляція Abs-CD13 Abs з активністю sCD13
Щоб оцінити, чи розчинний CD13 корелює з індукцією анти-CD13 Ab, був проведений кореляційний аналіз, використовуючи дані Cellomics та активність розчинного ферменту CD13. Не виявлено кореляції з активністю розчинного ферменту CD13 та анти-CD13 Ab (рис. 2; значення r: 0, 03, -0, 06, -0, 34 та 0, 15 для раннього cGVHD, ранніх контролів, пізнього cGVHD та пізній контроль).
Порівняння рівнів анти-CD13 Ab у клітинах Cellomics з активністю sCD13 у пацієнтів з ( a ) cGVHD ( b ) α-BMT, але не cGVHD (кров, зібрана через 6 місяців після BMT; ранні контролі) ( c ) пізній початок cGVHD ( d ) ало-BMT, але не cGVHD (кров, зібрана через 12 місяців після BMT; пізній контроль).
Повнорозмірне зображення
обговорення
Після недавньої демонстрації того, що розчинний CD13 сильно корелює з нещодавно діагностованим екстенсивним cGVHD у дітей, 7 у поєднанні з раніше виявленою зв'язком анти-CD13 Abs з CMV-інфекцією 11 та cGVHD 12 після BMT, ми спробували визначити, чи розчинний CD13-індукований CD13 реактивний Абс. як механізм, що лежить в основі cGVHD. Наш аналіз показує, що розчинний CD13 не сприяє патогенезу cGVHD через індукцію CD13-реактивного Abs, а також біомаркери анти-CD13 Abs для екстенсивного cGVHD.
Наша поширеність Abs-CD13 Abs (23-70%) відповідає попереднім повідомленням про Abs-CD13 Abs (45%) після BMT. У цьому попередньому дослідженні анти-CD13 Ab виявляли лише при вірусемії CMV або захворюванні. Дані про серологію CMV донора/реципієнта та CMV-інфекцію після BMT у нашому дослідженні не збирали, що унеможливило оцінку взаємозв'язку між анти-CD13 та CMV-інфекцією. Анти-CD13 нейтралізує ЦМВ-інфекцію, взаємодіючи з асоційованим з віріоном CD1316, і ці Абс з'являються при виявленні ЦМВ. Отже, наявність анти-CD13 Abs може бути пов'язана з реактивацією CMV після ало-BMT на відміну від cGVHD.
Механізм збільшення розчинного CD13 при cGVHD залишається незрозумілим. CD13, що зв’язаний з мембраною, широко експресується на декількох типах тканин, включаючи ті, які страждають на cGVHD. 9, 10 Розчинний CD13 може бути неспецифічним побічним продуктом інтенсивного запалення тканин. Альтернативно, амінопептидаза N ко-експресується з молекулами MHC II на ряді професійних APC 17, і структура NH2-кінцевої послідовності пептидів, зв’язаних з класом MHC II, може впливати на обробку Ag in vivo. 18
Нарешті, ми продемонстрували, що розчинний CD13 у cGVHD не індукує анти-CD13 Abs, хоча Abs присутній у деяких суб'єктів після ало-BMT. Механізм CD13 у патогенезі cGVHD залишається незрозумілим, але може включати опосередкування запальних реакцій Т-клітин.