автосомно-рецесивні

  • Предмети
  • Резюме
  • Вступ
  • Матеріали і методи
  • Пацієнти
  • Генетичні дослідження
  • Картування гомозиготності
  • Секвенування та аналіз екзома
  • Секвенування на основі капілярів
  • Функціональні дослідження
  • Культура клітин та аналіз загоєння ран.
  • Вилучення РНК та RT-qPCR у режимі реального часу
  • Вестерн-блот
  • Аналізи виживання клітин
  • Результати
  • Генетичні дослідження
  • Функціональні дослідження
  • Обговорення
  • Приєднання
  • GenBank/EMBL/DDBJ
  • Додаткова інформація
  • Файли зображень
  • Додаткова цифра
  • Документи Word
  • Додаткова інформація

Предмети

  • Генетична варіація
  • Загальногеномні дослідження асоціацій
  • Рак шкіри

Резюме

Вступ

Незважаючи на великі успіхи у вирішенні генетичних причин захворювання людей, виникли нові проблеми. Традиційні генетичні дослідження переходять від фенотипування до генотипування. При вивченні рідкісних та складних розладів з великою фенотиповою та/або генетичною неоднорідністю ця стратегія може зазнати невдачі. З моменту розробки нових технологій, особливо послідовності наступного покоління, з’явився новий підхід до вивчення генетичних захворювань, який називається зворотним фенотипом. 1 Це полягає у розкритті генетичної причини захворювання шляхом визначення того, які фенотипи виникають в результаті певних генетичних послідовностей. Секвенування наступного покоління є дуже потужним діагностичним інструментом у секвенуванні екзоми і може використовуватися для визначення генетичних причин багатьох рідкісних та складних порушень. 2 Секвенування наступного покоління також дозволяє зробити крок вперед у зворотному фенотипі. 3 Деякі приклади зворотного фенотипу з’являються в літературі. Чотири. П’ять

Дисхроматоз, який характеризується наявністю гіперпігментованих та гіпопігментованих плям, є прикладом рідкісного та складного розладу з великою фенотиповою неоднорідністю. При цьому захворюванні описані два синдроми, що перекриваються: спадковий симетричний дисхроматоз (HSD) та спадковий універсальний дисхроматоз. 6 Генетичні причини неоднорідні, і повідомляється як про автосомно-домінантне, так і про рецесивне успадкування. 6, 7 Причинно-наслідкові гетерозиготні варіанти вже ідентифіковані в трьох генах: SASH1, DSRAD та ABCB6. 8, 9, 10

Тут ми представляємо новий приклад зворотного фенотипу, який дозволив нам ідентифікувати гомозиготні варіанти в SASH1 як імовірну причину нового генодерматозу, накладеного на DSH.

Матеріали і методи

Пацієнти

Родовід ( до ), клінічний ( b - h ). Зверніть увагу на пробанд (III-6), невеликі гіпо та гіперпігментовані плями на обличчі та тулубі ( b, c, і ), тоді як аномальна картина пігментації більша і більш нерівномірна в кінцівках верхніх і нижніх кінцівок, де вона має ретикулярний вигляд ( F, g ). Також зверніть увагу на дифузну алопецію шкіри голови, вій та брів ( b, c ), дистрофія нігтів ( F, g ), дифузна долонеплантарна кератодермія з погано визначеними краями і товстою лускою ( d ). Подібні закономірності існують у кінцівках ураженої сестри III-3 ( h ).

Повнорозмірне зображення

Повний розмір таблиці

У постраждалої сестри пробанда III-3, 39-річної жінки, при народженні була нормальна шкіра. Він зазнав випадіння волосся, що також вплинуло на брови та вії у віці 6 місяців. Після цього з’явилися відшарування долонь і підошов. Гіпопігментовані та гіперпігментовані плями поступово з’являлися на тильній стороні її рук, ніг та обличчя. У віці 35 років він представив ССС в правому передпліччі, що вимагало ампутації. Під час останнього клінічного обстеження у віці 38 років він представив гіпо- та гіперпігментовані візерунки на тильній стороні кистей і стоп (рис. 1: h), з незначною гіперпігментацією ніг та передпліч. У решті тіла не було дефектів пігментації, але пацієнтка згадала, що, на відміну від постраждалого брата, вона знаходилася поза сонцем з раннього дитинства. У неї також була суха шкіра на підошвах ніг і долонь із лущенням, алопецією та дистрофічними нігтями, особливо нігтями на ногах. Його прорізування зубів, волосся на лобку та пахвах та статеве дозрівання були нормальними.

Генетичні дослідження

Картування гомозиготності

Генотип єдиного нуклеотидного поліморфізму (SNP) у всьому геномі був проведений у осіб II.1, II.2, III.3 та III.6, використовуючи матричну картографічну матрицю 250K Nsp (Affymetrix, Санта-Клара, Каліфорнія, США). Дані зображень оброблялись за допомогою консолі генотипування Affymetrix (GTC v4.1) для визначення викликів SNP та копіювання змін номера. Картування гомозиготності проводили за допомогою картографа гомозиготності. 11 Враховувались лише гомозиготні регіони розміром більше 1 мегабази.

Секвенування та аналіз екзома

Секвенування на основі капілярів

Капілярне секвенування проводили для підтвердження гомозиготного варіанту SASH1 та аналізу сегрегації варіанта в межах п’яти інших членів сім’ї (батьків, постраждалої сестри та двох незастрахованих братів III-4 та III-7). Довідковий номер SASH1 був NM_015278.3.

Функціональні дослідження

Культура клітин та аналіз загоєння ран.

Вилучення РНК та RT-qPCR у реальному часі

Загальну РНК екстрагували за допомогою реагенту TRI (Sigma), згідно з протоколом виробника. КДНК першого ланцюга синтезували з 500 нг загальної РНК за допомогою набору для синтезу кДНК першого ланцюга Maxima RT-qPCR від Fermentas (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Розчин qPCR у реальному часі містив 2 нг загальної РНК із зворотною транскрипцією, 300 нм прямого та зворотного праймерів та зелений буфер SYBR (Fermentas) для кінцевого об'єму 20 мкл. ПЛР проводили в трьох примірниках на 96-лункових планшетах, використовуючи LightCycler 480 (Roche). Людська гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа (GAPDH) використовувалась як інваріантний контроль. Послідовності праймерів, використовуваних для ПЛР у реальному часі, були SASH-1-For: ACCTGTTTCTCCGACGTGTG, SASH-1-Rev: GCCAAGCGACTCTTCGATCT GAPDH-For: TGCACCACCAACTGCTTAGC, GAPDH-Rev: GGGTGGTC.

Вестерн-блот

Клітини лізували протягом 20 хвилин на льоду в буфері RIPA (50 мкМ Трис, 150 мкМ NaCl, 1 мкМ NaF, 0,1% NP40, 0,25% DOC, 1 мкМ Na 3 VO 4, 1 мкМ PMSF та інгібітор білкового коктейлю (Sigma)) . Після центрифугування при 13000 g при 4 ° C протягом 20 хв концентрацію білка визначали за допомогою аналізу білка BCA (Sigma). Білки запускали на 10% SDS-PAGE і переносили на мембрану Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA, USA). Мембрану сушили антитілами проти SASH-1 (Sigma). Мічені білки виявляли за допомогою реагенту ECL (Pierce, Thermo Scientific) відповідно до рекомендацій виробника. Смуги у вестерн-ляпцях візуалізувались за допомогою системи зображення ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Аналізи виживання клітин

Оскільки було показано, що схема фосфорилювання SASH1 залежить від різних доз іонізуючого випромінювання низької та високої інтенсивності від фібробластів шкіри, ми припустили, що мутантні фібробласти SASH1 можуть бути більш чутливими як до ультрафіолетового випромінювання (УФ), так і до іонізуючого. 14 фібробластів SASH1 та контрольних фібробластів дикого типу AS405 культивували в DMEM + 10% FBS при 37 ° C. Через добу після трипсинізації клітини піддавали дії 0, 7, 5 та 15 Дж/м 2 УФК у відсутність середовища. Клітини вирощували протягом 4 днів, промивали PBS і прикріплені клітини трипсинізували і підраховували за допомогою лічильника частинок Z1 Coulter (Beckman Coulter, Лунд, Швеція). Виживання клітин розраховували як відношення кількості клітин, підрахованих після дії УФ, до кількості клітин за відсутності опромінення. Відсоток вижилих фібробластів SASH1 порівнювали з відсотком вижилих контрольних клітин AS405.

Для оцінки чутливості до іонізуючого випромінювання контрольні фібробласти SASH1 та AS405 культивували в DMEM + 10% FBS при 37 ° C. Через добу після посіву клітини опромінювали 0, 2 або 6 Гр за допомогою гамма-опромінювача джерела цезію. Через 3 дні клітини підраховували і визначали життєздатність клітин за допомогою аналізу виключення Trypan blue. Виживання клітин розраховували як відсоток життєздатних клітин після гамма-опромінення відносно неопромінених клітин. Відсоток вижилих фібробластів SASH1 порівнювали з відсотком вижилих контрольних фібробластів AS405.

Результати

Генетичні дослідження

Картографування гомозиготності у всьому геномі виявило сім локусів, що охоплюють 75 мегабаз і перекривають 710 генів RefSeq (Додаткова таблиця 1). У індексному випадку (III.6) чотири рідкісні кодуючі гомозиготні варіанти, включаючи безглузду зміну SASH1 (chr6: g.148855021G> A; c.1849G> A; p.Glu617Lys), були розташовані в цих регіонах. Таблиця 2) SASH1 кодує кандидат-супресор пухлини з сімейства сигнальних білків SLY. 15, 16, 17, 18, 19, 20 Цей варіант відсутній на сервері Exome Variant Server, dbSNP та локальних екзомах, передбачуваних шкідливим Condel і, можливо, шкідливим Polyphen2, і походить із добре збереженої послідовності (оцінка збереження GERP: 5090) (див. Інтернет-ресурси). Аналіз спільної сегрегації у всіх доступних родичів підтвердив їх присутність у гомозиготному стані як у постраждалих пацієнтів (III.6, так і у III.3), у гетерозиготному стані у обох батьків та у не ураженого брата (III7), а відсутність у незмінених сестра (III4). Варіанти були подані до бази даних ClinVar (номер підключення ClinVar: SCV000172081).

Повний розмір таблиці

Функціональні дослідження

Оскільки було показано, що SASH1 перешкоджає міграції клітин, 21 ми провели аналіз загоєння ран і продемонстрували, що фібробласти пацієнта можуть мігрувати краще в рану, ніж контрольні фібробласти (рис. 2). Проліферація фібробластів SASH1 знаходилася в тому ж діапазоні, що і у контрольних фібробластів (середнє значення для трьох контролів) (Додаткова фігура 1.1). Рівні білка SASH1 у фібробластах пацієнта та контрольних фібробластах виявилися нормальними (дані не наведені). Кількісне визначення кДНК SASH1 виявило нормальний рівень експресії мРНК у контрольних та фібробластах пацієнта (додаткова фігура 1.2). Не виявлено відмінностей між фібробластами дикого типу та мутантами щодо чутливості до іонізуючого випромінювання та УФ-променів під час аналізів виживання клітин (додаткові малюнки 1.3 та 1.4).

Аналіз загоєння ран, проведений на контрольних та фібробластах пацієнта: контрольні фібробласти ( до ) та фібробласти пацієнта ( b ) відразу після травми; контроль фібробластів c ) та фібробласти пацієнта ( d ) Через 16 год після травми. Вертикальні лінії обмежують рану шириною, що дорівнює (1, 2), тоді як фібробласти пацієнта демонструють більшу міграційну здатність, ніж контрольні клітини, через 16 год після рани ( c, d ).

Повнорозмірне зображення

Обговорення

Ми представляємо аутосомно-рецесивний синдром, не описаний раніше, що характеризується поєднанням патологічного малюнка пігментації (гіпо та гіперпігментовані макули тулуба та обличчя та ділянки ретикулярної гіпо та гіперпігментації кінцівок), алопеції, долонеплантарної кератодермії, дистрофії нігтів та SCC періодичні.

Відповідно до виникнення карциноми у постраждалих осіб у цьому дослідженні, нещодавно повідомлялося, що SASH1 бере участь у пухлинному розвитку різних типів раку. 15, 16, 17, 18, 19, 20 Клітинні експерименти показали, що SASH1 знаходиться в ядрі та цитоплазмі епітеліальних клітин і може регулювати міграцію та адгезію клітин завдяки своїй ролі у виступаючих мембранних структурах. 21 Завдяки своєму основному домену SH3, SASH1 взаємодіє з цитоскелетом актину і особливо з кортикактином, важливим регулятором динаміки ниток актину. 21 Аналіз міграції клітин показав, що фібробласти з варіантами SASH1 можуть мігрувати краще, ніж контрольні клітини. Однак для визначення точного молекулярного механізму буде необхідна додаткова функціональна робота.

Що стосується схильності до алопеції та раку шкіри, між SASH1 та TRAF6 може існувати ненормальна взаємодія. Повідомляється, що SASH1 є регулятором убіквітації TRAF6, а нещодавно виявлений гетерозиготний варіант TRAF6 у пацієнтів з гіпогідротичною ектодермальною дисплазією. 25, 26, 27 TRAF6, спочатку ідентифікований як регулятор NF-κB, також відіграє важливу роль у пухлинному розвитку, інвазії та метастазуванні, модулюючи різні сигнальні шляхи. 28, 29, 30 Нарешті, оскільки нещодавно повідомлялося, що SASH1 є молекулою ешафотів, яка бере участь в ендотеліальній сигналізації TLR4, яка бере участь у вроджених імунних реакціях, ми задаємось питанням, чи можуть долонно-підошовна кератодермія та алопеція бути наслідком хронічної грибкової інфекції, але це гіпотеза була виключена. 25

Дерматологічні захворювання дають ключові приклади захворювань із варіантами в одному і тому ж гені, які можуть наслідувати аутосомно-домінантне або рецесивне успадкування. Наприклад, ангідротична ектодермальна дисплазія спричинена варіантами EDAR та EDARADD, які викликають рецесивну втрату функції та домінуючі негативні ефекти. 31 32, 33 За рецесивного способу успадкування гетерозиготні особи не мають симптомів, тоді як гомозиготні пацієнти виявляють більш важкий фенотип, ніж пацієнти з аутосомно-домінантним способом успадкування. 33, 34 Ми припускаємо, що гомозиготний безглуздий варіант SASH1 може спричинити перекриття, але більш важкий фенотип, ніж опубліковані раніше гетерозиготні варіанти, пов’язані з DSH, і що безглуздий варіант p.Glu617Lys може бути пов’язаний із захворюванням лише на одній стадії гомозиготного . SASH1 не досліджувався у випадках з аутосомно-рецесивним DSH.

Клінічна картина сім'ї не відповідала жодному відомому клінічному об'єкту. РТС вже виключено, і існували деякі перекриваючі ознаки пігментної ксеродерми (табл. 1), але цей синдром був виключений через нормальну чутливість до ультрафіолетового світла. Цікаво, що пацієнти також продемонстрували певне збіг із синдромом Олмстеда, аутосомно-домінантним утворенням через гетерозиготні варіанти TRPV3. Синдром Олмстеда пов’язує двосторонню каліцьку пальмоплантарну кератодермію, дифузну алопецію, оніходістрофію та підвищений ризик розвитку ССС у кератотичних зонах. Однак пігментних уражень у цієї сутності ніколи не було виявлено, тоді як повідомлялося про звуження цифр та періорифічних кератотичних бляшок. 35

На закінчення ми повідомляємо про новий аутосомно-рецесивний генодерматоз, асоційований з безглуздими варіантами SASH1, який характеризується вражаючою асоціацією патологічної картини пігментації, яка перекриває DSH, алопецію, долонеплантарну кератодермію, дистрофію нігтів, аномалії зубів та схильність до SCC. Характеристика додаткових сімей із подібними клінічними ознаками буде необхідною для подальшого окреслення цієї відмінної клінічної сутності. У сукупності наші висновки розширюють фенотиповий спектр, асоційований з варіантами SASH1, і підкреслюють значення секвенування екзоми та зворотного фенотипу у розкритті генетичних причин рідкісних та складних захворювань.