активності

  • реферат
  • мета:
  • методи:
  • результати:
  • висновок:
  • вступ
  • Матеріали і методи
  • Тварини та експериментальний дизайн
  • Збір і обробка тканин
  • Біохімічний аналіз
  • Гістологічне та імуногістохімічне фарбування
  • На місці Аналізи ddP, опосередковані TdT, для маркування N-кінця
  • Вестерн-ляпси
  • Статистичний аналіз
  • результат
  • Блокада активності TLR2 зменшує і стабілізує атеросклеротичні ураження в брахіоцефальній артерії
  • Блокада TLR2 полегшує запалення в атеросклеротичних артеріях
  • Блокада TLR2 зменшує апоптоз макрофагів та експресію CHOP при поширених атеросклеротичних ураженнях
  • TLR2 опосередковує прискорену атеросклеротичну продукцію та регулює експресію CHOP та апоптоз у мишей з дефіцитом ApoE, які отримують дієту HC.
  • обговорення
  • Внесок автора

реферат

Сигналізація про подібний до рецептора 2 (TLR2) грає вирішальну роль у ініціюванні атеросклерозу. Метою цього дослідження було дослідити, чи може блокування активності TLR2 мати терапевтичний вплив на атеросклероз, що розвивається.

методи:

Сорок тижнів дефіциту аполіпопротеїну Е (ApoE -/-), яким годували нормальну дієту, вводили внутрішньовенно нейтралізуюче антитіло TLR2 або IgG, що відповідає ізотипу, протягом 18 тижнів. Подвійний нокаут мишей ApoE -/- Tlr2 -/- вважався позитивним контролем. В кінці лікування вимірювали рівень ліпідів у плазмі та аналізували морфологію нальоту, експресію прозапального цитокіну та артеріальний апоптоз. У другій частині цього дослідження шість тижнів мишей ApoE -/- та ApoE -/- Tlr2 -/-, які годували дієту з високим вмістом холестерину протягом 12-24 тижнів, досліджували на рівень експресії TLR2 та апоптотичні маркери в артерій.

результати:

Блокада активності TLR2 антитілом, що нейтралізує TLR2, або вибивання гена Tlr2 не змінили рівні ліпідів у плазмі крові у мишей ApoE -/-. Однак фармакологічні та генетичні маніпуляції значно зменшили розмір нальоту та судинний стеноз та підвищили стабільність нальоту в брахіоцефальних артеріях. Захисні ефекти антагонізму TLR2 були пов'язані з пригніченою експресією прозапальних цитокінів IL-6 та TNF-α та інактивацією факторів транскрипції NF-κB та Stat3. Крім того, блокування активності TLR2 послаблює індукований стресом апоптоз макрофагів в брахіоцефальних артеріях, що може сприяти диференціації некротичних ядер при атеросклерозі, що розвивається. Крім того, дієта з високим вмістом холестерину значно прискорила атеросклеротичну продукцію та збільшила експресію проапоптотичного білка CHOP та апоптоз у мишей ApoE -/-, ніж у мишей ApoE -/- Tlr2 -/-.

висновок:

Фармакологічна або генетична блокада активності TLR2 зменшує та стабілізує розвинені атеросклеротичні ураження у мишей ApoE -/-. Таким чином, націлювання на передачу сигналів TLR2 може бути перспективною терапевтичною стратегією проти запущеного атеросклерозу.

Атеросклероз - часта причина серцево-судинних захворювань. Серцево-судинні захворювання - головна причина смерті та зростаюча загроза здоров’ю людей у ​​всьому світі 1. Епідеміологічні та експериментальні дослідження підтвердили переважну роль у запаленні на всіх стадіях атеросклерозу, від утворення ранніх стійких атеросклеротичних бляшок до запущених бляшок, схильних до розривів 2, 3, 4, 5. Нещодавно кілька досліджень зосереджувались на впливах фармакологічних втручань на стабільність запущених бляшок, оскільки порушення нестабільних уражень сприяє розвитку гострого коронарного синдрому 4, 6, 7. Нестійкі бляшки характеризуються великими некротичними ядрами, заповненими ліпідами, капсульованими у тонкий волокнистий ковпачок, високим рівнем прозапальних медіаторів та матриксних протеаз та апоптозом. Розвиток нестабільних бляшок пов’язаний із залученням як вродженої, так і адаптивної імунної системи.

Толлоподібні рецептори (TLR) - це сімейство розпізнавальних рецепторів, які відіграють ключову роль у вродженому імунітеті та ініціюють запальні реакції. Лігування цих рецепторів ініціює активацію ядерного фактора KB (NF-kB), що призводить до експресії широкого спектру запальних генів 8, 9. Серед TLR, що характеризуються, TLR2 унікальний своєю здатністю гетеродимеризуватися з TLR1 або TLR6, що призводить до відносно широкої специфічності ліганду, включаючи ендогенні та екзогенні ліганди 10, 11. Примітно, що всі потенційні ендогенні агоністи TLR2, включаючи біглікан, високомобільний хромосомний білок 1 (HMGB1) та окислені ліпопротеїнові компоненти, виявляються при атеросклеротичних ураженнях 12, 13, 14. Крім того, сигнальний шлях TLR2 пов'язаний з реакцією на стрес ендоплазматичної сітки (ER). Стрес ER може збільшити експресію TLR2 in vitro та in vivo, а TLR2 сприяє апоптозу в макрофагах, які зазнають індукованого ліпідами стресу ER 15. Таким чином, TLR2 може бути потенційною мішенню для терапевтичних втручань при лікуванні атеросклерозу.

Дійсно, ліганди TLR2 та надмірна експресія TLR2 спостерігалися в атеросклеротичних бляшках людини, і на важливу роль TLR2 у запаленні та деградації матриксу вказують клітини, виявлені при атеросклеротичних ураженнях каротиди людини 16, 17. Крім того, дефіцит гена TLR2 на моделі миші суттєво стримував прогресування раннього атеросклерозу 18, 19. Однак даних про вплив TLR2 на запущені ураження на моделях тварин є обмежено. Використовуючи фармакологічне та генетичне пригнічення активності TLR2, ми дослідили терапевтичні та профілактичні ефекти блокади TLR2 на розвинені атеросклеротичні бляшки в брахіоцефальній артерії мишей з дефіцитом аполіпопротеїну Е (ApoE), які ще не оцінені. Ми виявили, що блокування активності TLR2 зменшує та стабілізує розвинені атеросклеротичні ураження у мишей з дефіцитом ApoE шляхом послаблення запалення та стресу ER в судинах. Наша робота свідчить про те, що активність TLR2 відіграє вирішальну роль у патогенезі розвиненого атеросклерозу, і що блокування цього сигнального шляху може бути перспективною стратегією лікування атеросклерозу та його ускладнень.

Матеріали і методи

Тварини та експериментальний дизайн

Мишей ApoE -/- Tlr2 -/- генерували з гетерозиготних схрещувань мишей ApoE -/- (фон C57BL/6, лабораторія Джексона) та мишей Tlr2 -/- (фон C57BL/6, лабораторія Джексона). Генотипи гомозиготних подвійних нокаутів або одноразових мишей ApoE були підтверджені за допомогою ПЛР, як описано вище 18. Усі тварини були розміщені в стандартних умовах для вологості, кімнатної температури та темних світлових циклів, з доступом до води та їжі ad libitum. Дослідження проводились відповідно до принципів, встановлених Інституційним комітетом з етики догляду за тваринами та лікування в біомедичних дослідженнях (Пекін, Китай).

У першому експерименті всіх мишей годували нормальним харчуванням [4% (мас./Мас.) Жиру, 20% (мас.) Білка, GB-14924]. У віці 40 тижнів мишей ApoE -/- Tlr2 +/+ випадковим чином розподіляли на 3 групи (n = 16 на групу) та обробляли фізіологічним розчином, відповідним до ізотипу антитілом IgG (SouthernBiotech, Бірмінгем, АР, США) або TLR2 нейтралізуюче антитіло. (R&D System, Міннеаполіс, Міннесота, США) внутрішньовенно. Дозування та терміни введення антитіл (ab) були визначені на основі наших попередніх досліджень 20, 21. Перший режим дозування становив 200 мкг/кг кожні 4 дні протягом 2 тижнів, а решта доз становила 100 мкг/кг один раз на тиждень протягом наступних 16 тижнів. Мишей ApoE -/- Tlr2 -/-, які називаються групою подвійного нокауту (DK), утримували за однакових умов. Всіх мишей забивали у віці 58 тижнів. У другому експерименті мишей ApoE -/- Tlr2 +/+ та ApoE -/- Tlr2 -/- годували атерогенною дієтою з високим вмістом холестерину (HC) [15,8% (w/w) жиру, 1,25% (w/w) ) мас.) холестерину] з 6-тижневого віку і жертвували для аналізу у віці 12, 18 та 24 тижнів (n = 8 на групу).

Збір і обробка тканин

Після того, як миші голодували протягом 4 годин, отримували кров для вимірювання ліпідів за допомогою ретроорбітального венозного сплетення. Потім мишей знеболювали 50 мг/кг внутрішньовенно пентобарбіталу і перфузували через лівий шлуночок холодним фосфатним сольовим розчином при фізіологічному тиску. Аорти швидко вирізали, швидко заморозили з дуги аорти для роздвоєння клубової кістки і підтримували при -80 ° C до аналізу білка. Вся брахіоцефальна артерія кожної тварини фіксувалась у 4% параформальдегіді протягом 24 годин при 4 ° C, вкладений у парафін та послідовно нарізаний (товщиною 5 мкм).

Біохімічний аналіз

Рівні загального холестерину в плазмі, ліпопротеїдів високої щільності (ЛПВЩ), холестерину ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ) та тригліцеридів визначали за допомогою комерційних наборів (Біозино, Пекін, Китай) відповідно до інструкцій виробників.,

Гістологічне та імуногістохімічне фарбування

Кожну п'яту ділянку серійних зрізів фарбували модифікованим пентахромним фарбуванням Мовата або червоним Сіріусом, щоб оцінити склад та стабільність розвинених атеросклеротичних бляшок у брахіоцефальній артерії, а також аналізували від 12 до 15 зрізів на мишу для кожного кольору. Забарвлені зрізи фотографували зі збільшенням у 200 разів, і 2-3 зрізи на зріз, що містить ціле ураження, захоплювали та аналізували за допомогою Image-Pro Plus 5.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, США). Середнє значення всіх зрізів представляло атеросклеротичне ураження однієї миші.

Для імуногістохімічного фарбування щонайменше 4 ділянки брахіоцефальної артерії на мишу інкубували з антитілами мишачих макрофагів щурів (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA), з моноклональними антитілами проти гладких м’язів миші. актин (α-SMA, 1: 100, Санта-Крус Біотехнологія, Каліфорнія, США) або антитіла кролика проти матриксної металопротеїнази (MMP) -2 (1: 100, Abcam, Кембридж, Великобританія). Зв’язані антитіла комплексували з пероксидазою-асоційованими вторинними антитілами та виявляли за допомогою діамінобензидину. Забруднені зрізи сфотографували зі збільшенням у 200 разів і зафіксували та проаналізували 2–3 поля зору, що містять ціле ураження на кожну ділянку, за допомогою Image-Pro Plus 5.0. Середнє значення всіх зрізів представляло експресію цільових білків при атеросклеротичному ураженні.

Для оцінки колокалізації макрофагів та гомологічного білка C/EBP (CHOP), антитіл до мишей до макрофагів щурів (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) та моноклональних антитіл до мишей ( 1: 100, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) використовували як первинні антитіла. Чотири зрізи тканини на миші інкубували з міченими Alexa 647 курячими анти-щурами та міченими Alexa 488 кролячими вторинними антитілами (1: 200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Розрізи переглядали за допомогою конфокального мікроскопа E2000U та оцінювали за допомогою програмного забезпечення Leica TCS SP2.

In situ TdT-опосередковані аналізи dUTP для маркування N-кінця

Апоптотичні клітини при атеросклеротичних ураженнях виявляли за допомогою наборів (TUNEL), опосередкованих TdT, за допомогою наборів (Promega, Madison, WI, USA). Ядра фарбували DAPI. TUNEL-позитивні ядра підраховували під інвертованим флуоресцентним мікроскопом Olympus I720. Для оцінки колокалізації макрофагів макрофаги були виявлені за допомогою антитіл до мишей до макрофагів щурів (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) з подальшим курячим вторинним антитілом, позначеним Alexa 647. (1: 200, Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США).

Вестерн-ляпси

Після гомогенізації тканин екстраговані білки відокремлювали 12% SDS-PAGE та імуноблотували специфічними антитілами, включаючи анти-MMP-2 (Abcam, Кембридж, Великобританія), анти-фосфо-NF-κB p65, anti-NF. -KB p65, розщеплена каспаза-3, анти-CHOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, США), анти-фосфо-Stat3, анти-Stat3, анти-інтерлейкін (IL) -6, анти-IL-10 або фактор протипухлинний некроз (TNF) -α (Санта Круз Біотехнологія, Каліфорнія, США). Вторинні сигнали антитіл були виявлені за допомогою реактивів ECL Plus Western blot (Amersham Biosciences, PA, США) згідно з інструкціями виробника.

Статистичний аналіз

Дані представлені як середнє значення ± SEM. Порівняння між кількома групами проводили з одностороннім ANOVA з використанням SPSS. Дані, які не показують нормального розподілу, аналізували за допомогою U-критерію Манна-Уітні. P

Блокування активності TLR2 не впливає на рівень ліпідів у плазмі крові. Загальний рівень холестерину (A), тригліцеридів (B), LDL-C (C) та HDL-C (D) визначали у 58-тижневих мишей ApoE -/-, які отримували фізіологічний розчин, IgG або TLR2ab iv протягом 18 тижнів та у мишей ApoE -/- з дефіцитом TLR2 (DK) годували кормом для тварин. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 12 мишей/група).

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Блокада TLR2 зменшує і стабілізує розвинені атеросклеротичні бляшки в брахіоцефальній артерії. (A та B) Фарбування Movat показало склад авансованих уражень із фізіологічним розчином, групами дефіциту IgG та TLR2ab та TLR2. Стрілки вказують на ерозію середовища. Штрихи шкали представляють 200 мкм на панелі A і 50 мкм на панелі B. Введення TLR2ab протягом 18 тижнів і дефіцит TLR2 значно зменшує середню площу ураження (C), максимальний стеноз ураження (D), максимальні некротичні ядра/наліт (E), і мінімальна середня товщина (F) у мишей з дефіцитом ApoE. L, просвіт; М, ЗМІ. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 10 мишей/група). b P

Блокада TLR2 стабілізує розвинені атеросклеротичні бляшки. У групах фарбування з дефіцитом TLR2ab та TLR2 червоне фарбування Sirius показало підвищений вміст колагену (A). Імуногістохімічне фарбування виявило більш рясний розподіл клітин гладкої мускулатури (В) та зменшення накопичення макрофагів (С) у ураженнях брахіоцефальної артерії. Стовпці шкали представляють 50 мкм. L позначає просвіт. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 10 мишей/група). b P c P

Блокада TLR2 пригнічує запалення судин в атеросклеротичних артеріях. Експресія MMP-2 (A і B), фосфорилювання NF-κB p65 (C), фосфорилювання Stat3 (D) та експресія цитокінів IL-6, TNF-α та IL-10 (E) були знижені в TLR2ab- лікування та дефіцит TLR2. Стовпці шкали представляють 50 мкм. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 6 мишей/група). b P

Дієта з високим вмістом холестерину (HC) підвищує експресію TLR2 у макрофагах, а блокада TLR2 зменшує індуковану HC HC експресію CHOP та апоптоз при атеросклеротичних ураженнях. (A) Забарвлення Моват виявило морфологію нальоту в брахіоцефальних артеріях мишей ApoE -/- Tlr2 +/+ та ApoE -/- Tlr2 -/-. Стовпці шкали представляють 200 мкм. Дефіцит TLR2 значно зменшив середню площу ураження (B) та розмір некротичного ядра (C) (n = 8 мишей/група). (D) Подвійна імунофлюоресценція виявила інфільтрацію макрофагів, що експресують TLR2, у ураження брахіоцефальних артерій мишей ApoE -/- у віці від 12 до 24 тижнів, яких поміщали на атерогенні дієти з 6-тижневого віку. Стовпці шкали представляють 20 мкм. У цьому віці миші ApoE -/- Tlr2 -/- демонстрували суттєво знижену експресію CHOP (E), Bcl-2 (F) та розщеплену каспазу-3 (G) в аорті. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 4-6 мишей/група). b P -/- миші одного віку. e P -/- у віці 12 тижнів на їжу для годування.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

обговорення

Запальні процеси відіграють ключову роль у розвитку атеросклерозу. Показано, що TLR2 бере участь у цьому процесі 11, 27. Відповідно до попередніх досліджень на ранніх стадіях атеросклерозу, блокування активності TLR2 зменшувало інфільтрацію макрофагів у бляшки; експресія медіаторів запалення, включаючи MMP-2, TNF-α та IL-6; та інактивація фактора транскрипції NF-κB 20, 21, 23. Крім того, антагонізм TLR2 також пригнічував експресію імунодепресивних медіаторів IL-10 та фактора транскрипції Stat3, припускаючи, що переваги блокування TLR2 залежать від значного гальмування запалення. Це дослідження пропонує перші докази TLR2-індукованого запалення при запущених ураженнях, щоб доповнити раніше виявлену роль TLR2 у ранньому атеросклерозі.

Нестабільність нальоту є важливою особливістю перенесеного атеросклерозу. Хоча механізми, що лежать в основі розриву бляшок, залишаються невловимими, було доведено, що багато факторів сприяють цьому процесу, включаючи накопичення макрофагів, високий рівень прозапальних медіаторів, переактивацію MMP та апоптоз VSMC та макрофагів. На додаток до регулювання запальних реакцій, ми спостерігали, що блокада TLR2 зменшує апоптоз макрофагів за допомогою аналізу TUNEL та імунофлюоресценції.

Підводячи підсумок, ми продемонстрували, що ген нокауту TLR2 у мишей ApoE -/- зменшує розмір нальоту та підвищує стабільність нальоту в брахіоцефальній артерії під час атеросклерозу внаслідок пригнічення ефектів запалення та апоптозу макрофагів, спричинених ER, і може слугувати перспективним терапевтична стратегія проти запущеного атеросклерозу. Оскільки для ініціювання захворювання необхідна підвищена експресія TLR2 на ендотеліальних клітинах, TLR2 може опосередковувати або посилювати викликані стресом апоптотичні сигнали ER при поширених атеросклеротичних ураженнях. Наша робота припускає, що фармакологічна блокада передачі сигналів TLR2 є привабливим підходом для майбутнього лікування атеросклерозу.

Внесок автора

Дослідження було розроблено Сяо-сін ВАНГ і Чжу-Вей ХУ; Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV та Hui-min YAN сприяли розробці методології; Експерименти виконували Сяо-сін ВАНГ, Сяо-сі ЛВ, Цзя-пін ВАНГ, Хуей-мін ЯН, Цзі-ян ВАН, Хань-чжі ЛІУ та Сяонін ФУ; Сяо-сін ВАНГ і Чжу-Вей ХУ проаналізували дані та написали статтю.