Snow технологічний університет BRN УНІВЕРСИТЕТ F TECHNLGY факультет Хімічний факультет хімії PTRAVIN BITECHNLGIÍ ФАКУЛЬТЕТ F ХІМІЯ ІНСТИТУТУ F FD НАУКИ І BITECHNLGY IZLACE BSAHVÝCH S Cannabis Sativa І ANTIFLGISTICKÝ ЕФЕКТ ISLATIN F CMPUNDS UDF Cannabis Sativa І ЇХ ANTI-INFLAMMATRY ЕФЕКТ DIPLMVÁ JOB MASTER S ТЕЗА AUTR PRACE PR. ЗУЗАНА БАРАНВА АВТОРСЬКИЙ НАДЗОР ФармДр. Даніела ВЕСЕЛА СУПЕРВІСР БРН 2015

технологій

Технологічний університет Брно Хімічний факультет Пуркінова 464/118, 61200 Брно 12 Форма виконання магістерської роботи Номер магістерської роботи: FCH-DIP0892/2014 Навчальний рік: 2014/2015 Кафедра: Кафедра харчової хімії та біотехнологій Студент: Вр. Зузана Баранова Дипломна програма: Харчова хімія та технології (N2901) Область дослідження: Харчова хімія та біотехнології (2901T010) Керівник дисертації PharmDr.Daniela Veselá Консультанти: док. Інж. Ірина Мелкова, к.т.н. Назва дипломної роботи: Виділення складових Cannabis sativa та їх антифлогістичний ефект Завдання дипломної роботи: 1. Розробити огляд літератури випуску 2. Описати використовувані методи оцінки 3. Обробляти виміряні результати експериментів 4. Оцінювати отримані результати в форма обговорення 11.5.2015 Дипломна робота подається у кількості, визначеній деканом, у секретаріат кафедри та в електронній формі керівнику дисертації. Це завдання є додатком до дипломної роботи. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Bc. Zuzana Baranová PharmDr.Daniela Veselá проф. RNDr. Івана Марова, к.с.н. Науковий керівник дисертації Директор Інституту в Брно, 30.1.2015 р. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - проф. Інж. Мартін Вайтер, к.т.н. Декан факультету

БАРАНВА, З. Виділення складових Cannabis sativa та їх антифлогічний ефект. Брно: Технологічний університет Брно, хімічний факультет, 2015. 73 с. Науковий керівник PharmDr. Даніела Весела. ДЕКЛАРАЦІЯ Я заявляю, що я підготував дипломну роботу самостійно і що я використав усі використані літературні джерела правильно та повністю. За змістом дипломна робота є власністю хімічного факультету Технологічного університету Брно і може використовуватися в комерційних цілях лише за згодою керівника дисертації та декана FCH, АЛЕ. підпис студента Подяка: Я хотів би подякувати PharmDr. Даніелю Веселею за час, який вона присвятила мені, та поради, які мене зворушили при розробці моєї дипломної роботи. Я також дякую RNDr. Ян Гошек, доктор філософії, який супроводжував мене при вимірюванні протизапальної активності та ознайомив з проблемою. 4

4.1.6 Поділ дробів. 47 4.2 Ідентифікація. 52 4.2.1 Аналіз УФ-спектрів. 52 4.2.2 Аналіз ІЧ-спектру. 53 4.2.3 Ідентифікація за допомогою ЯМР. 54 4.2.4 Результати ідентифікації ізольованих речовин. 55 4.3 Приготування клітин THP1. 56 4.3.1 Методи. 56 5 Висновок. 60 6 Цитована література. 63 7 Список скорочень. 71 6

Флавон апігенін лютеолін 5,7,4'-Н 5,7,3 ', 4'-Н Флавонол кемпферол морин кверцетин рутин 3,5,7,4'-Н 3,7,2', 4 ', 5'- Н 3,5,7,3 ', 4'-Н 5,7,3', 4'-Н; 3- R2 Флаванон (дигідрофлавон) гесперидин нарінгенін таксіфолін 5,7,3 ', 4'-H 5,7,4'-H 3,5,7,3', 4'-H Isoflavone genistin 5,4'-H; 7- R3 Антоціанін апігенідин ціанідин 5,7,4'-Н 3,5,7,4'-Н; 3,5-CH3 * Халькон тригідроксихалкон 2,4,2'-H R1: галлат; R2: рамноглюкоза; R3: глюкоза * Халькони є попередниками флавоноїдів, але деякі автори класифікують їх у загальному поділі флавоноїдів на групи [10]. 2.4.1 Основні підгрупи флавоноїдів 2.4.1.1 Халкони Халькони є попередниками флавоноїдів. Вони характеризуються відсутністю С-кільця в основній структурі флавоноїдного скелета. Тому їх також називають флавоноїдами з відкритим ланцюгом. Халькони включають, наприклад, флоридин, флоретин і хальконаренін. Вони містяться у значній кількості в помідорах, грушах, полуниці та деяких продуктах з клітковини. Халькони та їх похідні заслуговують на увагу завдяки своїм численним харчовим та біологічним перевагам [11,12]. Малюнок під абзацом (див. Малюнок 2) показує основну структуру, з якої отримані всі халкони. Chalkón brázok č. 2: Основна структура крейди 11

H H H H Кверцетин H 2.8.1.9 Vitexin brázok č. 16: Структура кверцетину Вітексин (див. Малюнок 17), класифікований як флавоноїд С-глюкозид. У щурах оцінювали метаболізм вітексину in vivo. Вітексин індукує апоптоз і пригнічує ріст пухлинних клітин, має потенційну антиоксидантну дію і може бути ефективно використаний для запобігання шкірних реакцій шкіри, викликаних УФ-випромінюванням, таких як вироблення вільних радикалів та пошкодження клітин шкіри [54,55]. Вітексин має потенційний гіпотензивний ефект завдяки блокуванню гангліїв. Він має значний захисний ефект від травм міокарда. Протизапальний ефект був показаний на основі його антигістамінних, антибрадикінінових та антисеротонінових властивостей. Інші клінічні застосування включають противірусну, антитиреоїдну, антисклеротичну та антигепатотоксичну активність. Здатність вітексину інгібувати супероксидні радикали призводить до потенційного застосування його омолоджуючої дії у косметичній промисловості [54,55]. Вітексин разом із ізовітексином, що застосовуються перорально, значно знижує рівень цукру в крові після їжі. вони стимулюють секрецію інсуліну та інгібують α-глюкозидазу, тим самим допомагаючи пацієнтам, які страждають на діабет [54,55]. H H H H H H H Hite Вітексин немає. 17: Структура вітексину 29

Струшуючи в різні розчинники, я розділив речовини на 4 порції. Порції випаровували на випарнику або ліофілізували у випадку води, а отриману суху речовину зважували. 3.2.1.2 Хімічні речовини Ацетонітрил з градієнтом (Шарлау) Бензол п.а. (Пента) Хлороформ п.а. (Пента) етилацетат п.а. (Пента) Оцтова кислота p.a. (Пента) Метанол p.a. (Пента) Метанольний градієнт (Шарлау) Вода для ВЕРХ, приготована з використанням апарату нижче. Рециклатна суміш, що складається приблизно з 10% води, 10% метанолу та 80% ацетонітрилу. см 20 см, товщина шару 0,2 мм (Merck) аналітична колона: Acentis Express C8, 15 см 2,1 мм, розмір частинок 2,7 мкм підготовча колонка: Supelcosil TM LC-8 SEMI-PREP, 25 см 10 мм, розмір частинок 5 мкм колонка: Силікагель Sigma-Aldrich 60 Å, розмір частинок 0,04 0,63 мм 3.2.1.4 Апарат Вакуумний роторний випарник Ліофілізатор BŰCHI Водна ванна B-480, Rotavapor R-114 (Бучі, Швейцарія) BŰCHI Вакуумний насос V- 700, Вакуумний контролер V-850, Rotavapor R-3 (Bűchi, Швейцарія) CHRIST Alfa 1 2 LD (Christ, Німеччина) 31

Колонна хроматографія Стаціонарна фаза: Рухлива фаза: силікагель із розміром зерен 0,040 0,063 мм хлороформ, бензол, метанол у співвідношенні 7: 2: 1 (об/об/об) Процедура: Фракції з фракції хлороформу збирали приблизно Фракції 100 150 мл, фракції гексану приблизно від 40 до 50 мл, потім аналізують за допомогою ТШХ та ВЕРХ. На основі подібності композиції їх поєднували, а потім випаровували на вакуумному випарнику. Аналітичний апарат високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ): Agilent 1100, УФ-детектор DAD Стаціонарна фаза: Acentis Express C8, 15 см 2,1 мм, розмір частинок 2,7 мкм Елюція: градієнт Мобільна фаза: Метод 1: 0. хвилина: 50% MeCN, 50 % HCH (0,2%) 24-та хвилина: 83% MeCN, 17% HCH (0,2%) 24,1. хвилина: 100% MeCN Потік: 0,3 мл/хв об'єм впорскування: 1 мкл Температура колонки: 40 C Виявлення: УФ на довжинах хвиль λ 254 та 280 нм Напівпрепарат Високопродуктивної рідинної хроматографії (ВЕРХ) Прилад: Система ВЕРХ YL9100 Стаціонарна фаза: Acentis Express C8, 25 см 10 мм, розмір частинок 5 мкм Елюція: градієнт Рухлива фаза: Метод 2: 0. хвилина: 90% перероблено, 10% HCH (0,2%) 15-та хвилина: 95% перероблено, 5% HCH (0,2%) 15.01. хвилина: 100% ACN 25.01. хвилина: 100% MeH 40.01. хвилина: 90% перероблено, 10% HCH (0,2%) Потік: 5 мл/хв об'єм введення: 25 мкл Температура колонки: 40 C Виявлення: УФ на довжині хвилі λ 254 та 280 нм 33

3.2.2.2 Ідентифікація УФ-спектрофотометрія УФ-спектри виділених речовин вимірювали за допомогою приладу Agilent DAD UV/VIS разом з ВЕРХ-аналізом. Ці спектри використовувались для оцінки структури сполук. Результати порівнювали з УФ-спектрами, заснованими на шкільній базі даних ВФУ в Брно. ІЧ-спектрофотометрія ІЧ-спектри вимірювали за допомогою приладу Nicolet Impact 400D FT-IR як функцію пропускання як довжину хвилі випромінювання. Зразки вимірювали у твердому вигляді методом ATR. Для вимірювання спектру застосовували корекцію ATR, корекцію для H2 і C2 та автоматичне згладжування спектру. Оцінюючи спектри, була отримана інформація про наявність різних функціональних груп у структурі аналізованого зразка. Ядерно-магнітно-резонансний аналіз за допомогою ядерно-магнітного резонансу був проведений за кордоном в Університеті Міссісіпі. 34